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細(xì)胞培養(yǎng)中的那些問(wèn)題
上海連橋生物科技有限公司
做細(xì)胞培養(yǎng)的同學(xué)如果互相交流會(huì)發(fā)現(xiàn),不同的實(shí)驗(yàn)室有些規(guī)則是不一樣的,,初學(xué)者經(jīng)常不知對(duì)錯(cuò),,小編今天就和大家總結(jié)一下這些問(wèn)題,,希望對(duì)你的細(xì)胞之路有所幫助。
購(gòu)買(mǎi)之細(xì)胞冷凍管經(jīng)解凍后,,為何會(huì)發(fā)生細(xì)胞數(shù)目太少之情形,?
研究人員在冷凍細(xì)胞之培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)細(xì)胞數(shù)目太少,大都是因?yàn)殡x心過(guò)程操作上的失誤,,造成細(xì)胞的物理性損傷,,以及細(xì)胞流失。建議細(xì)胞解凍后不要立刻離心,,應(yīng)待細(xì)胞生長(zhǎng)隔夜后再更換培養(yǎng)基即可,。
有必要做熱滅活嗎?
實(shí)驗(yàn)顯示,經(jīng)過(guò)正確處理的熱滅活血清,,對(duì)大多數(shù)的細(xì)胞而言是不需要的,。經(jīng)此處理過(guò)的血清對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)只有微小的促進(jìn),或*沒(méi)有任何作用,,甚至通常因?yàn)楦邷靥幚碛绊懥搜宓馁|(zhì)量,,而造成細(xì)胞生長(zhǎng)速率的降低。而經(jīng)過(guò)熱處理的血清,沉淀物的形成會(huì)顯著的增多,,這些沉淀物在倒置顯微鏡下觀察,,像是“小黑點(diǎn)",常常會(huì)讓研究者誤以為是血清遭受污染,,而把血清放在37℃環(huán)境中,,又會(huì)使此沉淀物更增多,使研究者誤認(rèn)為是微生物的分裂擴(kuò)增,。
細(xì)胞冷凍管解凍培養(yǎng)時(shí),,是否應(yīng)馬上去除DMSO?
除少數(shù)特別注明對(duì)DMSO敏感之細(xì)胞外,,絕大部分細(xì)胞株(包括懸浮性細(xì)胞),,在解凍之后,應(yīng)直接放入含有10-15ml新鮮培養(yǎng)基之培養(yǎng)角瓶中,,待隔天再置換新鮮培養(yǎng)基以去除DMSO 即可,,如此可避免大部分解凍后細(xì)胞無(wú)法生長(zhǎng)或貼附之問(wèn)題。
DMSO之等級(jí)和無(wú)菌過(guò)濾之方式為何,?
冷凍保存使用之DMSO等級(jí),,必須為T(mén)issue culture grade之DMSO (如Sigma D2650),其本身即為無(wú)菌狀況,,第一次開(kāi)瓶后應(yīng)立即少量分裝于無(wú)菌試管中,,保存于4 C,避免反復(fù)冷凍解凍造成DMSO之裂解而釋出有害物質(zhì),,并可減少污染之機(jī)會(huì),。若要過(guò)濾DMSO,則須使用耐DMSO之Nylon材質(zhì)濾膜,。
可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,?
不能。每一細(xì)胞株均有其特定使用且已適應(yīng)之細(xì)胞培養(yǎng)基,,若驟然使用和原先提供之培養(yǎng)條件不同之培養(yǎng)基,,細(xì)胞大都無(wú)法立即適應(yīng),造成細(xì)胞無(wú)法存活,。
可否使用與原先培養(yǎng)條件不同之血清種類(lèi),?
不能。血清是細(xì)胞培養(yǎng)上一個(gè)極為重要的營(yíng)養(yǎng)來(lái)源,,所以血清的種類(lèi)和品質(zhì)對(duì)于細(xì)胞的生長(zhǎng)會(huì)產(chǎn)生極大的影響,。來(lái)自不同物種的血清,在一些物質(zhì)或分子的量或內(nèi)容物上都有所不同,,血清使用錯(cuò)誤常會(huì)造成細(xì)胞無(wú)法存活,。
培養(yǎng)基中是否須添加抗生素,?
除于特殊篩選系統(tǒng)中外,一般正常培養(yǎng)狀態(tài)下,,培養(yǎng)基中不應(yīng)添加任何抗生素,。
細(xì)胞冷凍培養(yǎng)基之成份為何?
動(dòng)物細(xì)胞冷凍保存時(shí)最常使用的冷凍培養(yǎng)基是含5 - 10% DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來(lái)細(xì)胞生長(zhǎng)用之新鮮培養(yǎng)基均勻混合之,。注意:由于DMSO 稀釋時(shí)會(huì)放出大量熱能,,故不可將DMSO直接加入細(xì)胞液中,必須使用前先行配制完成,。
細(xì)胞欲冷凍保存時(shí),,細(xì)胞冷凍管內(nèi)應(yīng)有多少細(xì)胞濃度?
冷凍管內(nèi)細(xì)胞數(shù)目一般為1x106 cells/ml vial,,融合瘤細(xì)胞則以5x106 cells/ml vial 為宜。
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)中重要嗎,?它在溶液中不穩(wěn)定嗎,?
L-谷氨酰胺在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)是重要的。脫掉氨基后,,L-谷氨酰胺可作為培養(yǎng)細(xì)胞的能量來(lái)源,、參與蛋白質(zhì)的合成和核酸代謝。L-谷氨酰胺在溶液中經(jīng)過(guò)一段時(shí)間后會(huì)降解,,但是確切的降解率一直沒(méi)有最終定論,。L-谷氨酰胺的降解導(dǎo)致氨的形成,而氨對(duì)于一些細(xì)胞具有毒性,。
GlutaMAX-I是什么,?培養(yǎng)細(xì)胞如何利用GlutaMAX-I?這個(gè)二肽有多穩(wěn)定,?
GlutaMAX-I 二肽是一個(gè)L-谷氨酰胺的衍生物,,其不穩(wěn)定的alpha-氨基用L-丙氨酸來(lái)保護(hù)。一種肽酶逐漸裂解二肽,,釋放L-谷氨酰胺供利用,。GlutaMAX-I二肽非常穩(wěn)定,即使在121磅滅菌20分鐘,,GlutaMAX-I 二肽溶液有最小的降解,,如果在相同條件下,L-谷氨酰胺幾乎*降解,。
血清解凍后發(fā)現(xiàn)有絮狀沉淀物出現(xiàn),,該如何處理?
血清中沉淀物的出現(xiàn)有許多種原因,,但的原因是由于血清中脂蛋白的變性所造成,,而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在血清解凍后,,也會(huì)存在于血清中,亦是造成沉淀物的主要原因之一,。但這些絮狀沉淀物,,并不影響血清本身的質(zhì)量。若欲去除這些絮狀沉淀物,,可以將血清分裝至無(wú)菌離心管內(nèi),,以400g稍微離心,上清液即可接著加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過(guò)濾,。我們不建議您以過(guò)濾的方法去除這些絮狀沉淀物,,因?yàn)樗赡軙?huì)阻塞您的過(guò)濾膜。
為什么要熱滅活血清?
加熱可以滅活補(bǔ)體系統(tǒng),。激活的補(bǔ)體參與溶解細(xì)胞事件,,刺激平滑肌收縮,細(xì)胞和血小板釋放組胺,,激活淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,。在免疫學(xué)研究,培養(yǎng)ES細(xì)胞,,昆蟲(chóng)細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞時(shí),,推薦使用熱滅活血清。
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