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液相色譜柱使用常見問題解析

時間:2019/6/27閱讀:3278

1對于一根常用的C18柱,,拿到一根新柱的時候應(yīng)該怎樣進(jìn)行活化及維護(hù)?為什么要這樣做,?

  答:新柱活化,,實(shí)際上是一個平衡的過程,除了用流動相平衡外,,有時候還必須用所測樣品對新柱進(jìn)行平衡,,特別是測定分子量比較高的多肽,尤其重要,。因?yàn)榉肿恿扛叩奈镔|(zhì)分子,,擴(kuò)散速度慢,平衡所需時間也相應(yīng)較長,。具體平衡方式也很簡單,,多進(jìn)幾次樣品,直到峰面積和保留時間穩(wěn)定,,再進(jìn)行正式進(jìn)樣測定,。

  如果要加快平衡時間,把前面用來平衡的進(jìn)樣樣品濃度加大,,或者不等洗脫完成,,連續(xù)進(jìn)樣多針。用待測物對新柱平衡,,目的是將硅膠基質(zhì)填料表面具有非特異性吸附的位點(diǎn)的吸附能力飽和掉,。

2測定多肽,一般采用什么柱子,?流動相是乙腈和水,,還有微量的TFA。特別是像類似三肽的短肽,,應(yīng)該怎么選擇柱子,?

  答:分子量不高的多肽一般選用常規(guī)C18柱就能測定,也有用離子交換柱,、水性C18柱和Hilic親水作用柱的,。

3氨基柱在進(jìn)酸性樣品時,很傷柱子,,如使用一段時間后,,柱效降低,峰形改變,如何恢復(fù),?

  答:氨基柱測酸性樣品,,應(yīng)該是用氨基柱的HILIC模式。酸的存在可能會使略帶負(fù)電荷的氨基官能團(tuán)質(zhì)子化,,導(dǎo)致使用一段時間后對于某些類的分析物保留性質(zhì)有所改變或表現(xiàn)在柱效下降,。建議:用5-10倍的柱體積的含0.5-1.0%NH3的乙腈-水(50:50)溶液沖洗該柱(沖洗后當(dāng)然要再用不含堿的流動相洗去多余氨),之后再進(jìn)行分析這類酸性分析物時建議在流動相中略微添加少許氨如0.1%,。

4色譜柱的技術(shù)都有哪些,?比如封尾等,這些技術(shù)在應(yīng)用時都體現(xiàn)在哪里,?

  答:色譜柱技術(shù)包括填料技術(shù)和裝柱技術(shù),,填料技術(shù)自不待言,填料的好壞對色譜柱分離性能和選擇性有決定性影響,。裝柱技術(shù)也沒有想象中的這么簡單,,不同固定相、不同粒徑,、不同柱管內(nèi)徑和長度,,裝柱工藝都有所不同,,要裝出緊密,、穩(wěn)定、均一的柱床,,更多是一門藝術(shù),,需要經(jīng)驗(yàn)積累。

  國內(nèi)和國外想比,,我認(rèn)為色譜柱的差距在于:國內(nèi)公司以前都不會自己開發(fā)填料,,一般買國外現(xiàn)成填料裝柱,買到的填料質(zhì)量控制權(quán)不在自己手里,。另外因?yàn)檠b柱歷史短,,經(jīng)驗(yàn)積累少,裝柱工藝也沒有*達(dá)到國外水平,。另外,,對色譜柱性能很關(guān)鍵的基礎(chǔ)材料-----裸硅膠,國產(chǎn)的還不過關(guān),,在純度,、粒徑和孔徑的均一性方面和國外產(chǎn)品相比,差距很大,。

5色譜柱技術(shù)的差距在哪里,?

  答:液相色譜柱裝填實(shí)際上是有一定技巧和程序,可能還有一些運(yùn)氣。一般使用高壓勻漿方法裝填,。也就是能讓填料在溶劑內(nèi)均勻地懸浮,。然后用瞬間高壓壓實(shí),這實(shí)際上用到了不同比例的勻漿液體,,和合適的壓力,。壓力太大,顆粒破碎,,壓力太小,,塔板數(shù)少。同時壓力需要穩(wěn)定,,不然分布不均,,拖尾嚴(yán)重。同時還有頭上平整程度,。套上套,,就可以用了。

6柱子在什么情況下可以清洗一下篩板呢,?原來也討論過這個問題,,我也拆下來清洗過,但我看到柱前段的污染更甚,,于是就用刀片刮了刮,,然后把清洗好的篩板安裝上去。問題解決了,,但使用壽命會不會減少呢,?

  答:柱頭污染了,就取出污染的,,再裝一些填料,。因?yàn)榧尤肽愎瘟诵┨盍希敲次⒂^的塔板數(shù)就少了,。假入你刮得不多,,僅表面,可能就是一些臟物,,所以,,問題解決。但是今后還會有同樣問題,,再掛,,那么不小心刮,影響柱效,。建議還是裝一個預(yù)柱,。

7如果柱子取下來放置一段時間,,需要做什么保護(hù)嗎?

  答:對一般的反相柱,,也就是洗干凈后放到純甲醇(乙腈)或者是80%左右的甲醇(乙腈)水中,,然后用堵頭塞緊柱兩頭,以免保存溶劑揮發(fā),,應(yīng)該不需要做特殊的保護(hù),。

8流動相中加入適量的四氫(防和諧)呋喃可以改善峰形的機(jī)理是什么?

  答:《液相色譜方法及應(yīng)用》于世林編著的上面說:甲醇為質(zhì)子給予體,、乙腈為質(zhì)子接受體,、四氫(防和諧)呋喃是偶極溶劑,應(yīng)該除了極性影響,,還有另外的影響因素,,至于分離機(jī)理,還是比較復(fù)雜的,,不能看成是個方法,。

9關(guān)于色譜柱的填裝問題。我個人認(rèn)為現(xiàn)在色譜柱的填裝一般有3種情況:

  (1)國外生產(chǎn)填料并填裝完成成品賣到國內(nèi),;

  (2)國外生產(chǎn)填料,,國內(nèi)填裝銷售;

  (3)國內(nèi)生產(chǎn)填料,,國內(nèi)填裝銷售,。

  一般情況下,第1種情況賣的貴,,但質(zhì)量好,!可是如果是填料的生產(chǎn)很復(fù)雜的話,,那么填裝上國內(nèi)也跟不上去嗎,?為什么換在國內(nèi)填裝就會出現(xiàn)或多或少的一些小問題呢?

  答:國內(nèi)填裝會出現(xiàn)質(zhì)量小問題,,和國內(nèi)目前普遍做事沒有國外嚴(yán)謹(jǐn)有關(guān)吧,。如果工藝技術(shù)上沒有問題,又能制訂并切實(shí)執(zhí)行一整套嚴(yán)格的生產(chǎn)質(zhì)量管理措施,,國內(nèi)填裝和國外填裝并無區(qū)別,。

10國產(chǎn)色譜柱在市場上占有比例如何啊,?

  國內(nèi)色譜柱市場還沒有人進(jìn)行過科學(xué)統(tǒng)計,,連一年色譜柱銷售總量也眾說紛云,更別說國內(nèi)生產(chǎn)色譜柱所占份額了,。我估計是占30%左右吧,。

11預(yù)柱或保護(hù)柱用還是不用的問題,!原來分析中藥品種時,我一直都是用保護(hù)柱,。但來到新公司后,,發(fā)現(xiàn)大家都沒有使用,幾個實(shí)驗(yàn)室連保護(hù)柱都沒找到一個,,也就是說大家從來都沒有用過,。后來問一個老員工,說是有可能影響藥品分析,。想問:安裝保護(hù)柱后會影響樣品分析嗎,?我們做的大多是頭孢類的抗生素。

  答:應(yīng)該這樣說,,加上保護(hù)柱,,肯定有利于保護(hù)色譜柱不受一些顆粒物質(zhì)的堵塞,肯定有害于分離度和柱效,,因?yàn)楸Wo(hù)柱中間有著死體積的存在,。但是如果保護(hù)柱接得好,并且盡量控制其匹配性和經(jīng)常更換,,分離度和柱效應(yīng)該影響并不大,。頭孢類的抗生素也要看到底是原料藥還是制劑嘍,有些原料藥,,可以根據(jù)色譜柱的損耗選擇添加預(yù)柱(中間是個篩板),,制劑的話,如果有輔料嚴(yán)重干擾或者流動相鹽分比較大,,那還是配個保護(hù)柱比較好,。

12用的是四元梯度泵A50%甲醇B50%水經(jīng)常出現(xiàn)停或進(jìn)氣泡這是什么原因,?

  答:水/甲醇比例在55:45時,,黏度和柱壓有個極大值。50:50接近了這個極值,,柱壓是比較高的,,但影響柱壓大的還是填料粒徑和色譜柱內(nèi)徑,你這個實(shí)例中不知用的什么規(guī)格的色譜柱,?系統(tǒng)壓力高,,可能會因溶劑泵中的過濾頭供液速度跟不上而導(dǎo)致氣泡進(jìn)入系統(tǒng),停機(jī)也應(yīng)該是因?yàn)闅馀葸M(jìn)入壓力下降的原因,,可考慮更換液體通量更大的過濾頭,。

13資料顯示:在正常條件下,填料粒度>20µm時,,干法填充制備柱較為合適,;顆粒<20µm時,,濕法填充較為理想。各種填充方法有什么區(qū)別,?

答:填充方法一般有4種

 ?、俑邏簞驖{法,多用于分析柱和小規(guī)模制備柱的填充,;

 ?、趶较蚣訅悍ǎ琖aters專(防和諧)利,;

 ?、圯S向加壓法,主要用于裝填大直徑柱,;

 ?、芨煞āV畛涞募夹g(shù)性很強(qiáng),,大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室使用已填充好的商品柱,。為什么以20um為分界點(diǎn)?填料方法的前三種都是濕法嗎,,能不能對四種填充方法做一個簡短的說明,?

14想請您具體說明一下反沖色譜柱的方法,是不連檢測器嗎,?

  答:反沖就是將柱子反向連到系統(tǒng)中,。因?yàn)橛形廴疚锓礇_出來,當(dāng)然不連檢測器,,出液端直接接到廢液瓶就可以,。

15網(wǎng)上對柱子是否可以反沖一直有爭論,那什么樣的柱子可以反沖,,什么不可以,。反沖后是正者用,還是反著用,。具體到各型號柱子不僅是ODS柱,,其他如正向柱、氨基柱,、離子交換柱等都有解釋。

  答:一般的正相反相柱應(yīng)該都能反沖,,只有兩端篩板孔徑不對稱的柱子不能反沖,,不過目前這樣的柱子已經(jīng)比較少見了。反沖是為了把柱頭的污染物沖洗掉,,反沖后還是正著用比較好,,以免柱子的兩頭都被污染,。我們一直提倡的是:正向使用,反向沖洗,。

16在做方法開發(fā)的時候,用乙腈和水作為流動相,在調(diào)整梯度的時候發(fā)現(xiàn),,剛開始用60%乙腈,RT為2.5分鐘,,調(diào)到40%乙腈,,RT沒有變化,30%也沒有變化,一直調(diào)到20%的時候,,RT突然變到了約13分鐘,,請問這是什么原因?我用的是離子交換柱,。

  答:離子交換柱的保留時間主要由洗脫液的離子強(qiáng)度和pH決定,,你現(xiàn)在講的比較簡單,需要把你的方法說的詳細(xì)一點(diǎn)才能做具體的分析,。譬如分析物是什么情況,,其含有極性電離基團(tuán)和非極性基團(tuán)是什么性質(zhì)?離子交換柱是聚合物基質(zhì)還是硅膠基質(zhì),?水相是什么緩沖鹽,?

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