將外源基因?qū)氚屑?xì)胞的方法有很多,，其中一種比較普適,、成功率又比較高的方法為顯微注射法。

首先，我們說說這種方法的原理：顯微注射法即是利用管尖極細(xì)（0.1至0.5μm）的玻璃微量注射針,，將外源基因片段直接注射到原核期胚或培養(yǎng)的細(xì)胞中，然后藉由宿主基因組序列可能發(fā)生的重組,、缺失,、復(fù)制或易位等現(xiàn)象而使外源基因嵌入宿主的染色體內(nèi)，實現(xiàn)宿主細(xì)胞的基因改造,。

一般的動物細(xì)胞,，直徑大約10微米左右；人類真核細(xì)胞直徑范圍在：3～30微米,，其中人卵細(xì)胞直徑約為100微米,。故直徑為0.2微米的顯微注射器針頭可以為各種類型和任意大小的動物細(xì)胞提供精準(zhǔn)的、重復(fù)性良好的細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞旁注射,。在注射的過程中,，動物細(xì)胞膜也會被刺破。但因為動物細(xì)胞膜良好的彈性和流動性,，在細(xì)胞膜被刺破以及細(xì)胞內(nèi)注入或者抽取點物質(zhì)之后,，細(xì)胞膜還是可以恢復(fù)完整的，恢復(fù)好的細(xì)胞可以繼續(xù)存活,，正常生長,。當(dāng)然操作手法也會影響實驗的成功率，針對不同細(xì)胞的操作手法方面的研究,，現(xiàn)在也有很多文章發(fā)表出來,。

顯微注射技術(shù)的長處為：任何DNA在原則上均可傳入任何種類的動物細(xì)胞內(nèi)，對于所轉(zhuǎn)的外源基因沒有長度上的限制,，目前已證明數(shù)百kb的DNA片段均可以成功轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞并整合進其染色體組,。操作過程如圖所示：

接下來，我們再說說顯微注射器針頭的制作：顯微注射過程中使用的微量移液管是用微電極拉制儀來制作的,，先將玻璃毛細(xì)管加熱到其熔化的溫度,，再將其拉制成所需的合適大小的直徑和錐形，微量移液管小頭的直徑（小至0.2微米）與纖維操縱器的高精度相關(guān),，它可以用于精準(zhǔn)的移液,。

    SUTTER微電極拉制儀P-000                                                日本NARISHIGE拉制儀PC-100

顯微注射器的結(jié)構(gòu)如下圖所示：

注射器中加好需要注射的樣品之后，通過運用顯微注射儀（壓力注射）可以獲得將微量移液管中的物質(zhì)擠噴入靶細(xì)胞中,。

               日本NARISHIGE顯微注射儀IM-400    

                                       美國warner顯微注射儀PLI-100A

現(xiàn)在,，我們來歸納一下顯微注射法的應(yīng)用：

（一）顯微注射法可用來做轉(zhuǎn)基因動物：顯微注射技術(shù)是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術(shù)將外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受體細(xì)胞的基因組內(nèi),，再通過胚胎移植技術(shù)將整合有外源基因的受精卵移植到受體動物的孑宮內(nèi)發(fā)育,，從而獲得轉(zhuǎn)基因動物,。顯微注射法是目前轉(zhuǎn)移效率基較好的一種基因轉(zhuǎn)移方法，可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進行轉(zhuǎn)移,；外源基因的長度不受限制, 可達100kb ,；實驗周期相對比較短。它的不足之處是 ：導(dǎo)入外源基因整合位點和拷貝數(shù)無法控制,；常導(dǎo)致插入位點附近宿主DNA 片段缺失、重組等突變,，可造成動物嚴(yán)重的生理缺陷,。盡管如此，由于顯微注射技術(shù)直接對基因進行操作,，整合率較高,，因而仍是目前建立轉(zhuǎn)基因動物極為重要的方法。

（二）顯微注射法在植物,、動物的細(xì)胞發(fā)育研究的應(yīng)用：將特定的分子探針及衍生的細(xì)胞間質(zhì)成分導(dǎo)入活體細(xì)胞,，為研究控制細(xì)胞功能的調(diào)控機制提供了新的視野。

（三）顯微注射法用于做克隆動物：供體細(xì)胞的細(xì)胞核用顯微注射器移入卵母細(xì)胞后,，在卵母細(xì)胞相關(guān)因子的作用下,，發(fā)生了重編程回復(fù)到發(fā)育的起點狀態(tài)。核重編程的過程就是使在體細(xì)胞中被關(guān)閉,，而在正常胚胎發(fā)育中表達的基因重新被激活的過程,。

重編程有三種可能的結(jié)果：

1，供核基因組沒有進行重編程,，重構(gòu)胚很快死亡,；

2，部分重編程,，重構(gòu)胚在不同的發(fā)育階段死亡 ,；

3，重編程,，產(chǎn)生正常的克隆動物,。

（四）顯微注射器可以實現(xiàn)單細(xì)胞提取：在不改變細(xì)胞生存環(huán)境的情況下,，用顯微注射器對單個細(xì)胞進行活細(xì)胞提取,。可單獨提取細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞核,，或者同時提取提取細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核,。提取后細(xì)胞仍可存活。相比于傳統(tǒng)的裂解方式,，用顯微注射器提取的樣本更為干凈,，可以得到很好地電鏡圖像,。

（五）顯微注射法可以實現(xiàn)更優(yōu)的CRISPR-Cas轉(zhuǎn)染方式：顯微注射器能夠進行高速、高效地將CRISPR-Cas復(fù)合物注入細(xì)胞,，幫助您克服對于傳統(tǒng)方式極難轉(zhuǎn)染的細(xì)胞基因編輯問題,。

我們再介紹一下顯微注射法的具體操作過程，顯微注射實驗的操作需要在顯微鏡下進行,，如圖所示：

（一）在注射針內(nèi)裝液：使用無菌的微量加樣器從微注射針的后部加入待注射樣品,。

（二）注射針安裝和定位：

1， 將裝液后的針頭的游離端安在連接器上,，然后旋緊連接器以固定針頭,，再將其固定到微操作儀的托針管上。

2,， 把載有待注射樣本的培養(yǎng)皿放在顯微鏡載物臺上,，用低倍物鏡對準(zhǔn)細(xì)胞調(diào)焦；

3,， 移動針頭并在顯微鏡下調(diào)整微操作儀,，直到針頭的陰影在視野的中心上方；

4,， 使用工作用放大倍數(shù),，調(diào)準(zhǔn)細(xì)胞焦距，找到針尖,。

（三）顯微注射：

1,，使針尖對準(zhǔn)細(xì)胞的待注射部位（細(xì)胞與針尖在同一焦面上），旋轉(zhuǎn)推進旋鈕,，針刺入細(xì)胞內(nèi)（卵膜,、細(xì)胞膜、核膜）,。

2,， 旋轉(zhuǎn)加樣旋鈕，將樣本加入,，并離開細(xì)胞,。

余下，就是將操作好的細(xì)胞放回好好培養(yǎng),，實驗結(jié)束,。

顯微注射法的缺點是：實驗所需的設(shè)備精密而昂貴、操作技術(shù)需要長時間的練習(xí),，以及每次只能注射有限的細(xì)胞,。