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NK-92細(xì)胞特性

NK-92細(xì)胞生長(zhǎng)特性為懸浮生長(zhǎng)，收到細(xì)胞后先觀察瓶身是否完整,，無(wú)漏液現(xiàn)象,，培養(yǎng)基是否澄清透亮，在顯微鏡下觀察細(xì)胞,；

用75%的酒精擦拭瓶身后將細(xì)胞培養(yǎng)瓶先豎立靜置2~4個(gè)小時(shí),，讓細(xì)胞沉降到底部,；細(xì)胞靜置完后，將瓶中上面部分培養(yǎng)基小心吸出,，留底部細(xì)胞和3ml左右培養(yǎng)基在原瓶,；

吸出的細(xì)胞培養(yǎng)基離心收集細(xì)胞沉淀，離心轉(zhuǎn)速1000轉(zhuǎn)3分鐘,，或根據(jù)您的離心機(jī)實(shí)際情況而定,，NK-92細(xì)胞對(duì)離心敏感，轉(zhuǎn)速不宜過(guò)高,；用2~3mlNK-92完培將得到的細(xì)胞沉淀重懸后,，放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng)過(guò)夜，一個(gè)T25培養(yǎng)體積是5~6毫升,；

NK-92細(xì)胞可按照200U/ml的濃度補(bǔ)加IL-2,。

培養(yǎng)瓶為不透氣瓶蓋，一定要擰松到不掉的程度,，使細(xì)胞充分透氣,；培養(yǎng)瓶橫放，瓶口擰松透氣,，培養(yǎng)過(guò)夜,；

顯微鏡下觀察細(xì)胞，視細(xì)胞密度和培養(yǎng)基消耗情況,，進(jìn)行傳代,。不建議直接進(jìn)行離心操作，因?yàn)榻?jīng)過(guò)運(yùn)輸顛簸和各種處理,，細(xì)胞很可能達(dá)不到最佳狀態(tài),。盡量不要吹散細(xì)胞團(tuán)，加完液輕晃培養(yǎng)瓶即可,。

細(xì)胞培養(yǎng)注意事項(xiàng)

NK-92細(xì)胞為懸浮生長(zhǎng),，大部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，少數(shù)細(xì)胞分散,，并且細(xì)胞間隙會(huì)有較多的死細(xì)胞和細(xì)胞碎片,，且培養(yǎng)過(guò)程中經(jīng)常能觀察黑色的顆粒和小黑點(diǎn)，這些黑點(diǎn)大概是細(xì)胞帶的,，一般少量黑點(diǎn)不增殖不會(huì)影響細(xì)胞的生長(zhǎng),，若黑點(diǎn)繁殖生長(zhǎng)則懷疑細(xì)胞污染，會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng),，甚至使細(xì)胞死亡,。

NK-92細(xì)胞對(duì)IL-2敏感。培養(yǎng)基中IL-2降解，將導(dǎo)致細(xì)胞狀態(tài)變差,。IL-2長(zhǎng)期保存溫度為-20℃,，解凍后置于4℃冰箱保存，4℃保存不應(yīng)超過(guò)兩周,。配制好的新鮮培養(yǎng)基要盡快用完,，使用前預(yù)熱,，使用完畢后放回4℃冰箱保存,；

NK-92細(xì)胞對(duì)離心敏感。正常培養(yǎng)時(shí),，換液周期為2~3天,，建議交替使用半量換液和離心換液法，即半量換液2~3次后,，離心全量換液一次,。盡量減少離心次數(shù)，細(xì)胞狀態(tài)不佳或細(xì)胞量少的時(shí)候,，一般不建議離心,。

細(xì)胞團(tuán)塊是否需要吹散？

團(tuán)塊需要吹散,，但不用刻意吹散成單顆,；

正常傳代或者離心換液后吹打，控制吹打次數(shù)以及力度,，即使細(xì)胞都分散成單個(gè),，也會(huì)在1~2天內(nèi)聚集起來(lái)；細(xì)胞團(tuán)太大時(shí),，需要分散,；

細(xì)胞凍存的時(shí)候，細(xì)胞需要盡量分散,，否則影響凍存效果,。

換液方法
(1) 補(bǔ)液法：每2~3天補(bǔ)加適量（根據(jù)培養(yǎng)容器和原來(lái)細(xì)胞懸液體積來(lái)定，T25瓶一次補(bǔ)液1~2毫升即可）新鮮培養(yǎng)基,，同時(shí)補(bǔ)加200U/mlIL-2,，補(bǔ)加2-3次之后，離心全部換液,。

(2) 半換液法：以T25瓶子（瓶中裝有5ml培養(yǎng)基）為例,，豎起瓶子靜置一段時(shí)間（豎瓶前輕拍培瓶，讓輕貼底部的細(xì)胞團(tuán)浮起來(lái)）,，待細(xì)胞沉底（肉眼觀察細(xì)胞沉底情況）,，小心吸出2.5ml上清轉(zhuǎn)移到離心管，1000rpm 3~5min離心，離心后的細(xì)沉淀用2.5ml新鮮培養(yǎng)重懸后放回原瓶繼續(xù)培養(yǎng),。細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí),，聚集的細(xì)胞團(tuán)會(huì)逐漸增大，正常的細(xì)胞團(tuán)在顯微鏡下呈現(xiàn)白色透亮狀,。若細(xì)胞聚集太多,，出現(xiàn)細(xì)胞團(tuán)中部發(fā)暗時(shí)，可進(jìn)行傳代,。

傳代方法

將細(xì)胞團(tuán)用移液器輕輕吹散（一般吹2-3次即可,，吹打力度不可過(guò)大，否則會(huì)出現(xiàn)大量死細(xì)胞和細(xì)胞碎片）,，均分到兩個(gè)瓶子里,，每瓶再補(bǔ)充等量培養(yǎng)基。細(xì)胞對(duì)營(yíng)養(yǎng)要求很高,，細(xì)胞量過(guò)多時(shí)會(huì)影響細(xì)胞生長(zhǎng),；細(xì)胞團(tuán)塊過(guò)大時(shí)，需要稍微吹散,，注意控制吹打次數(shù),，不需要全部吹散。

細(xì)胞凍存

推薦使用90%FBS+10%DMSO的凍存液配比,，NK-92細(xì)胞可適量補(bǔ)加IL-2,；盡量吹散細(xì)胞，注意控制吹打力度,。

細(xì)胞復(fù)蘇

復(fù)蘇后,，用6ml新鮮培養(yǎng)基，重懸細(xì)胞,；離心后去除上清用1~2mL培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,，注意要少次輕柔吹打。
瓶子豎著放進(jìn)培養(yǎng)箱,，以增加細(xì)胞局部密度,，瓶蓋保持透氣；
細(xì)胞生長(zhǎng)需要穩(wěn)定的環(huán)境,，可每天觀察1次,，不要頻繁拿出培養(yǎng)箱觀察