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呋喃唑酮代謝物檢測試劑盒

使用說明書

（酶聯(lián)免疫法）

 1 原理及用途

本試劑盒采用間接競爭ELISA方法檢測蜂蜜,、魚,、蝦,、禽,、肝臟等中的呋喃唑酮代謝物（AOZ）,，試劑盒由預(yù)包被偶聯(lián)抗原的酶標(biāo)板、辣根酶標(biāo)記物,、抗體,、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣品溶液,，樣本中的呋喃唑酮代謝物和酶標(biāo)板上預(yù)包被偶聯(lián)抗原競爭抗呋喃唑酮代謝物抗體,，加入酶標(biāo)記物后，用TMB底物顯色,，樣本吸光度值與其所含呋喃唑酮代謝物含量成負(fù)相關(guān),，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中呋喃唑酮代謝物的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.05ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：25℃,，45min～15min

2.3 檢測下限：

組織,、肝臟…………………………0.1ppb

奶粉、蛋粉,、飼料…………………0.1ppb

蜂蜜,、牛奶、腸衣…………………0.1ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

呋喃唑酮代謝物…………………100%

呋喃它酮代謝物…………………<0.1%

呋喃妥因代謝物…………………<0.1%

呋喃西林代謝物…………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

組織,、肝臟…………………………80±25%

蜂蜜,、牛奶、腸衣…………………75±15%

奶粉,、蛋粉,、飼料…………………85±25%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液：各1ml

0ppb、0.05ppb,、0.15ppb,、0.45ppb、1.35ppb,、4.05ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液（紅蓋）：100ppb…………1ml

衍生化試劑（黑蓋）………………10ml

酶標(biāo)記物（紅蓋）…………………5.5ml

抗體工作液（藍(lán)蓋）………………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

20X濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

2X復(fù)溶液（黃蓋）…………………50ml

說明書………………………………1份

4 需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀,、打印機(jī)、均質(zhì)器 ,、氮氣吹干裝置,、振蕩器、離心機(jī),、刻度移液管,、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl,、多道300µl

4.3 試劑：乙酸乙酯,、正己烷、氫氧化鈉,、濃HCl,、K₂HPO₄·3H₂O、亞硝基鐵（K₂Fe(CN)₅(NO)_?2H₂O）,、ZnSO₄·7H₂O

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭,，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：0.36M亞硝基鐵溶液（牛奶、奶粉樣本）

11.9g亞硝基鐵加去離子水至100ml溶解,。

配液2：1.04M硫酸鋅溶液（牛奶,、奶粉樣本）

    29.8g硫酸鋅加去離子水至100ml溶解。

配液3：0.1M  K₂HPO₄ 溶液

    稱11.4g K₂HPO_4?3H₂O加去離子水溶解定溶至500ml,。

配液4：1M  HCL

    8.6mL濃HCL加去離子水定容至100mL,。

配液5：1M  NaOH溶液

    稱取4g NaOH，加去離子水定容至100ml,。

配液6：復(fù)溶液

    將2×復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋,，用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月,。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 牛奶樣本處理方法

1）取5ml樣本于離心管中，加250ul 亞硝基鐵溶液（配液1）振蕩混合30秒,，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒,，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘；

2）取上清1.1ml,，加4ml去離子水,、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘,；

3）在37℃過夜孵育(約16小時)或50℃（超過50℃時會影響分層效果）水浴孵育3小時,；

4）分別加入5ml 0.1M K₂HPO₄ 溶液，0.4ml 1M NaOH溶液和5ml的乙酸乙酯,，振蕩5分鐘,；

5）室溫下4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘,；

6）取出2.5ml的上層液到另一個離心管中,，50-60℃氮氣或空氣吹干；

7）用1ml正已烷溶解殘留物,，加入1ml復(fù)溶工作液充分振蕩混合30秒,；室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘,；

8）去除上層正已烷,，取50μl下層液用于分析。

    樣本稀釋倍數(shù)為2    檢測下限：0.1ppb

5.3.2 奶粉,、蛋粉樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中,，加入4ml去離子水、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑,，振蕩5分鐘,；

2）在37℃過夜孵育(約16小時)或50℃（超過50℃時會影響分層效果）水浴孵育3小時；

3）加250ul 亞硝基鐵溶液（配液1）振蕩混合30秒，加250ul 硫酸鋅溶液（配液2）振蕩混合30秒,，15℃4000轉(zhuǎn)/分離心10分鐘,；

4）取全部上清到另一個離心管中，后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法,，4）”

5.3.3 蜂蜜,、組織、腸衣,、肝臟,、飼料、雞蛋樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于離心管中,，加入4ml去離子水,、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘,；

2）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法,，3）”

5.3.4 熟食樣本處理方法

1）稱取1±0.05g均質(zhì)樣于50ml離心管中，加入4.5ml甲醇和0.5ml去離子水,，振蕩2min,，室溫4000轉(zhuǎn)/分，離心5分鐘,，去除全部液體,；

2）加入5ml乙氰和5ml正己烷，振蕩2min,，室溫4000轉(zhuǎn)/分,，離心5分鐘，去除全部液體,；

3）在沉淀中加入4ml去離子水,、0.5 ml 1M 鹽酸溶液和100μl衍生化試劑，振蕩5分鐘,；

    注：熟食的添加回收試驗請在此步加入高標(biāo)準(zhǔn),。

4）后續(xù)接“5.3.1 牛奶樣本處理方法，3）”

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出,，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解,，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架,，將不用的微孔板放入自封袋,，保存于2-8℃。

實驗開始前,，用去離子水將20×濃縮洗滌液按20倍稀釋成工作洗滌液,。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號,，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置,。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中,，然后加酶標(biāo)記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液,，用蓋板膜封板,，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應(yīng)45分鐘,。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜,，將孔內(nèi)液體甩干，用工作洗滌液250µl/孔充分洗滌5次,，每次間隔30秒,，用吸水紙拍干（拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl,，再加底物液B 50µl,，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘,。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻,，終止反應(yīng),。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10分鐘內(nèi)完成,。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值,，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo),，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo),，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度,，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進(jìn)行計算,，更便于大量樣本的準(zhǔn)確,、快速分析。

8 注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低,。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況,，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象,。所以洗板拍干后應(yīng)立即進(jìn)行下一步操作,。

8.3 混合要均勻,，洗板要*，在ELISA分析中的再現(xiàn)性,，很大程度上取決于洗板的一致性,。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板,，避免光線照射,。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑,。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì),，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時,，表示試劑可能變質(zhì),。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚,。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存,，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年,，生產(chǎn)日期見包裝盒,。