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非洲豬瘟病毒檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：非洲豬瘟病毒檢測試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）

英文名稱：African Swine Fever virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒適用于非洲豬瘟病毒檢測,，可用于臨床非洲豬瘟病毒感染的輔助診斷，但不作確診使用,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對非洲豬瘟病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含非洲豬瘟病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào),。利用熒光定量PCR儀對PCR過程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對照為滅菌純水,，陽性對照為含非洲豬瘟靶基因的質(zhì)粒,。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融,，有效期12個(gè)月,。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列 、Roche LightCycler 480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.血液或血清樣品：用一次性無菌注射器抽取靜脈血2mL,，注入無菌的干燥玻璃管,，室溫(22-25℃)放置30-60min，血標(biāo)本可自發(fā)完成凝集析出血清,，或直接使用水平離心機(jī),，3000rpm離心5min，吸取上層血清,，轉(zhuǎn)移至1.5mL滅菌離心管中備用,；;

2.肌肉或內(nèi)臟樣品：首xuan脾臟，其次為扁桃體,、淋巴結(jié),、腎臟、骨髓等取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨,，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢；

3.鈍緣軟蜱：將收集的鈍緣軟蜱放入有螺旋蓋的樣品瓶中進(jìn)行樣本提??；

4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

5.標(biāo)本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,，避免反復(fù)凍融。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

 

（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心,，按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),，剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5 μl,、終體積25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25 μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序,。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

 （1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。

 （2）陰性對照：Ct值＞40或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤38或有明顯指數(shù)增長期,。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在38～40范圍內(nèi),。此時(shí)應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在38～40范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性,。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞40或無Ct值,。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10³Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤3%,。

【注意事項(xiàng)】

1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理,；

2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,；

3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用,，以免污染,；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺(tái)清潔,；

4. 吸取反應(yīng)液時(shí),，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前,，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時(shí)離心,；

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放,；

7. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記；

8. 檢測過程中使用過的吸頭,，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋,，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒,；

9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號(hào)試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用,。