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雞馬立克氏病檢測（實時熒光PCR法）說明書
閱讀：19 發(fā)布時間：2025-5-23雞馬立克氏病檢測（實時熒光PCR法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：雞馬立克氏病檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Marek’s Disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T /盒 ＆ 50T /盒
【預期用途】
馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細胞浸潤和增大,，引起肢(翅)麻痹，以及性腺,、虹膜,、各種臟器,、肌肉和皮膚腫瘤病。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評估有重要指導意義.
【檢驗原理】
本試劑盒針對MDV高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針,，在反應體系中含MDV基因組模板的情況下，PCR反應得以進行并釋放熒光信號,。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T /盒 | 50T /盒 |
1 | MDV PCR反應液 | 500 μL×1管 | 1000 μL×1管 |
2 | MDV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | MDV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水,，陽性對照為含馬立克氏靶基因的質粒,。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融,，有效期12個月,。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler 480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀。
【樣本要求】
1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,，采集方法如下：
(1) 咽喉拭子,，采取時要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液,；
(2) 泄殖腔拭子,，將拭子深入泄殖腔轉一圈沾取糞便；
(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用,。
2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。
3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉入無菌離心管中,，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢,。
4.應避免標本間交叉污染。
5.標本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存,，標本應凍存于-80℃以下,，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
（4）PCR反應管蓋后將PCR反應管轉移至樣本處理區(qū),。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl,、終體積25μl/管，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置,，并記錄放置順序。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增,。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集MDV熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正,，設置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期,。
2.標本結果判定：
（1）陽性：標本檢測結果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。
（2）可疑：標本檢測結果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應對標本進行重復檢測,，如重復實驗結果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性,，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結果Ct值＞38或無Ct值,。
【檢驗結果的解釋】
通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 |
FAM | |
陽性（＋） | 標本中檢測出MDV |
陰性（－） | 標本中未檢出MDV |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結果,。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結果,。
3. 樣本在采集,、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結果,。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為103 Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室,，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理,；
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用,，不得交叉使用,，以免污染；檢測結束后,，應立即對工作臺清潔,；
4. 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡,；上 PCR 儀前,，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結果不準確,；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,，并應瞬時離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū),，并單獨存放,；
7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管,，并應避免在PCR反應管上進行任何標記,；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測結束的PCR 反應管,，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9. 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置,；不同批號試劑不能混用,；并在有效期內(nèi)使用。