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雞馬立克氏病檢測（實(shí)時熒光PCR法）說明書

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：雞馬立克氏病檢測試劑盒（實(shí)時熒光PCR法）

英文名稱：Marek’s Disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T /盒 ＆ 50T /盒

【預(yù)期用途】

馬立克氏病(MDV)是雞的一種淋巴組織增生性腫瘤病,，其特征為外周神經(jīng)淋巴樣細(xì)胞浸潤和增大，引起肢(翅)麻痹,，以及性腺,、虹膜,、各種臟器,、肌肉和皮膚腫瘤病,。本試劑盒利用實(shí)時熒光PCR原理，主要用于雞馬立克氏病的定性篩查檢測及療效評估有重要指導(dǎo)意義.

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對MDV高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含MDV基因組模板的情況下,，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

 

 

 

 

 

 

          注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含馬立克氏靶基因的質(zhì)粒,。

【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融，有效期12個月,。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler 480,、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實(shí)時熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1.活禽樣品取咽喉拭子和泄殖腔拭子,，采集方法如下：

(1) 咽喉拭子,，采取時要將拭子深入喉頭及上愕裂來回刮3次～5次，取咽喉分泌液,；

(2) 泄殖腔拭子,，將拭子深入泄殖腔轉(zhuǎn)一圈沾取糞便；

(3) 將咽喉拭子和泄殖腔拭子一起放入盛有 1.0 mL 生理鹽水的離心管中備用,。

2.血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢,。

3.肌肉或內(nèi)臟樣品：取少量樣品（2～3克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉(zhuǎn)入無菌離心管中,，3000rpm/min 離心10分鐘取上清待檢,。

4.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染。

5.標(biāo)本收集后可立即檢測,；若不能立即檢測,，可置于2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下,，避免反復(fù)凍融,。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。

n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。

（4）PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl,、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。

（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期,。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。

（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果,。

2. 被檢樣本在采集,、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

3. 樣本在采集,、運(yùn)輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10³ Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%

【注意事項(xiàng)】

1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室,，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理,；

2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作,，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理；

3. 各區(qū)域物品均為專用,，不得交叉使用,，以免污染；檢測結(jié)束后,，應(yīng)立即對工作臺清潔,；

4. 吸取反應(yīng)液時，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡,；上 PCR 儀前,，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確,；

5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時離心；

6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨(dú)存放,；

7. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記,；

8. 檢測過程中使用過的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒；

9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號試劑不能混用,；并在有效期內(nèi)使用,。