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禽霍亂桿菌檢測試劑盒（雙色實(shí)時熒光PCR法）說明書
閱讀：192 發(fā)布時間：2025-5-14禽霍亂桿菌檢測試劑盒（雙色實(shí)時熒光PCR法）說明書
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：禽霍亂桿菌檢測試劑盒（雙色實(shí)時熒光PCR法）
英文名稱：Fowl cholera Detection Kit (Dual Channel Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】25T /盒 & 50T /盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒利用實(shí)時熒光PCR原理,，定性檢測禽霍亂桿菌，對禽霍亂桿菌的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義,。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對禽霍亂桿菌病菌基因的特定基因設(shè)計特異性引物和熒光標(biāo)記探針,，利用儀器對 PCR過程中相應(yīng)通道的信號強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時監(jiān)測和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T /盒 | 50T /盒 |
1 | 禽霍亂 PCR反應(yīng)液 | 500μL×1管 | 1000μL×1管 |
2 | 禽霍亂 陽性對照 | 40μL×1管 | 40μL×1管 |
3 | 禽霍亂 陰性對照 | 40μL×1管 | 40μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水,，陽性對照為含禽霍亂桿菌靶基因的質(zhì)粒。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融,，有效期12個月。
【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時熒光定量PCR儀,。
【樣本要求】
1. 取病死禽心血樣本,，肝、脾等組織樣本,。
2. 應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染,。
3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃，長期保存不會影響本試劑盒檢測結(jié)果,，但有可能影響培養(yǎng)法檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性,。
4. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量,。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。
（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序,。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集禽霍亂桿菌A基因熒光信號 HEX通道采集禽霍亂桿菌B基因熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None,。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期,。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時應(yīng)對標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測,，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 | |
FAM | HEX | |
- | - | 標(biāo)本中未檢出禽霍亂桿菌A,，B基因 |
- | + | 標(biāo)本中檢測出禽霍亂桿菌B基因，未檢出禽霍亂桿菌A基因 |
+ | - | 標(biāo)本中檢測出禽霍亂桿菌A基因,，未檢出禽霍亂桿菌B基因 |
+ | + | 標(biāo)本中檢測出禽霍亂桿菌A,，B基因 |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 被檢樣本在采集,、運(yùn)輸,、儲存以及處理過程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
3. 樣本在采集,、運(yùn)輸,、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽性結(jié)果。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為103 Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤3%,。
【注意事項(xiàng)】
1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理,；
2. 為避免核酸降解,，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用,，以免污染,；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔,；
4. 吸取反應(yīng)液時,，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前,，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時離心,；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放,；
7. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記,；
8. 檢測過程中使用過的吸頭,，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi)，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,，切忌開蓋,，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒,；
9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置；不同批號試劑不能混用,；并在有效期內(nèi)使用,。