化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
牛支原體檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說(shuō)明書(shū)
閱讀：130 發(fā)布時(shí)間：2025-5-8牛支原體檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說(shuō)明書(shū)
【產(chǎn)品名稱(chēng)】
通用名稱(chēng)：牛支原體檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）
英文名稱(chēng)：Mycoplas Mabovis Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒
【預(yù)期用途】
牛支原體(Mycoplas Mabovis)是牛支原體病引起的一種可導(dǎo)致多種病癥的傳染病,，主要引起肉牛和奶牛發(fā)病，初生犢牛對(duì)該病最易感,；其中由牛支原體引起的肺炎稱(chēng)為傳染性牛支原體肺炎或牛支原體肺炎,，是目前已知
的由牛支原體引起的對(duì)病畜危害最為嚴(yán)重的一種病癥。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,，定性檢測(cè)牛支原體,，對(duì)牛支原體的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗(yàn)原理】
本試劑盒針對(duì)牛支原體基因設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含有牛支原體 DNA模板的情況下,，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào)。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析,。
【主要組成成份】
序號(hào) | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | 牛支原體 PCR反應(yīng)液 | 500μL×1管 | 1000μL×1管 |
2 | 牛支原體 陽(yáng)性對(duì)照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | 牛支原體 陰性對(duì)照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 說(shuō)明書(shū) | 1份 | 1份 |
注：陰性對(duì)照為滅菌純水,，陽(yáng)性對(duì)照為含牛支原體靶基因的質(zhì)粒。
【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融,，有效期12個(gè)月。
【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler 480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀,。
【樣本要求】
1. 如使用原始標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),。標(biāo)本（血液、痰液,、咽拭子,、腦脊液、菌落,、菌苔等）應(yīng)為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標(biāo)本,。
2. 如需在增菌后進(jìn)行PCR檢測(cè)，則應(yīng)使用選擇性增菌液對(duì)原始標(biāo)本進(jìn)行增菌,。
3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè),，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存；如需長(zhǎng)期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃,。
【檢驗(yàn)方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量。
n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無(wú)菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。
（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用DNA/RNA提取試劑盒提取核酸即可,，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。
4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 牛支原體 熒光信號(hào) |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴(kuò)增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時(shí)采集熒光信號(hào)） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期,。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,。
（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性,，否則為陰性,。
（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值。
【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】
通道及檢測(cè)結(jié)果 | 標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果解釋 |
FAM | |
陽(yáng)性（＋） | 標(biāo)本中檢測(cè)出牛支原體 |
陰性（－） | 標(biāo)本中未檢出牛支原體 |
【檢驗(yàn)方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果,。
2. 被檢樣本在采集,、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成DNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。
3. 樣本在采集,、運(yùn)輸、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果,。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為103Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%,。
【注意事項(xiàng)】
1. 使用本試劑盒的實(shí)驗(yàn)室,，應(yīng)嚴(yán)格按照國(guó)家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴(kuò)增檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理規(guī)范進(jìn)行管理；
2. 為避免RNA降解,，樣本處理過(guò)程應(yīng)在0-4℃條件下操作,，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè)；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理,；
3. 各區(qū)域物品均為專(zhuān)用,，不得交叉使用,，以免污染；檢測(cè)結(jié)束后,，應(yīng)立即對(duì)工作臺(tái)清潔,；
4. 吸取反應(yīng)液時(shí)，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡,；上 PCR 儀前,，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確,；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時(shí)離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨(dú)存放,；
7. 為防止熒光干擾，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記,；
8. 檢測(cè)過(guò)程中使用過(guò)的吸頭，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測(cè)結(jié)束的PCR 反應(yīng)管,，切忌開(kāi)蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺(tái)及各種實(shí)驗(yàn)用品應(yīng)定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進(jìn)行消毒；
9. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號(hào)試劑不能混用,；并在有效期內(nèi)使用。