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豬偽狂犬病毒（gE）PCR檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）說(shuō)明書

【產(chǎn)品名稱】 

通用名稱：豬偽狂犬病毒（gE）PCR檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）

英文名稱：Porcine Pseudorabies virus gE gene Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒

【預(yù)期用途】

豬偽狂犬病毒（Porcine Pseudorabies virus，PPRV gE）在分類學(xué)上屬皰疹病毒科豬皰疹病毒屬,。本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,，定性檢測(cè)PPRV gE,，對(duì)PRV引起的豬的疫病的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)PPRV gE高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針，在反應(yīng)體系中含PPRV gE基因組模板的情況下,，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào),。利用儀器對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道的信號(hào)強(qiáng)度進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析,。

【主要組成成份】

注：陰性對(duì)照為豬基因組DNA,，陽(yáng)性對(duì)照為PPRV gE經(jīng)滅活處理的核酸提取物。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融,，有效期12個(gè)月。

【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 新鮮采集的咽拭子,、鼻拭子標(biāo)本,，并使用滅菌生理鹽水懸浮。

2. 患病動(dòng)物的腦,、心,、肝、脾,、肺,、腎、扁桃體等病理組織,。

3. 標(biāo)本收集后若不能立即檢測(cè),，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存,；如需長(zhǎng)期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃。

4. 標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融,。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量,。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。

(4)蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN,、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本DNA各5μl,、終體積25μl/管，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。

4.PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序,。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值,，線形為直線或輕微斜線,，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè)，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,，則判定為陽(yáng)性，否則為陰性,。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值,。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果。

2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用,，對(duì)于本試劑盒檢測(cè)陽(yáng)性結(jié)果應(yīng)進(jìn)一步使用培養(yǎng)法進(jìn)行確診,。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10²CFU，產(chǎn)品CV值≤5%,。

【注意事項(xiàng)】

1. 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū),、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服,、儀器,、耗材應(yīng)獨(dú)立使用，不能混用,；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭,；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作,；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置,。

2. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰、陽(yáng)性對(duì)照,。

3. 為保證試劑不受標(biāo)本污染,，必須將混合酶液及PCR反應(yīng)液保存于試劑準(zhǔn)備區(qū)。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時(shí)離心,。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號(hào)試劑不能混用,。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None,。

9. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄,。