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豬流行性腹瀉病毒PCR檢測(cè)試劑盒操作說(shuō)明書(shū)

【產(chǎn)品名稱】

通用名稱：豬流行性腹瀉病毒PCR檢測(cè)試劑盒（實(shí)時(shí)熒光PCR法）

英文名稱：Porcine epidemic diarrhea virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)

【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒

【預(yù)期用途】

本試劑盒利用實(shí)時(shí)熒光PCR原理,，定性檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒，對(duì)豬流行性腹瀉病毒引起的疾病診斷及療效評(píng)估有重要指導(dǎo)意義,。

【檢驗(yàn)原理】

本試劑盒針對(duì)豬流行性腹瀉病毒的高度保守區(qū)域設(shè)計(jì)特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含豬流行性腹瀉病毒基因組模板的情況下，PCR反應(yīng)得以進(jìn)行并釋放熒光信號(hào),。利用熒光定量PCR儀對(duì)PCR過(guò)程中相應(yīng)通道信號(hào)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和輸出,，實(shí)現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果的定性分析。

【主要組成成份】

注：陰性對(duì)照為豬基因組DNA,，陽(yáng)性對(duì)照為失去活性的豬流行性腹瀉病毒cDNA,。

【儲(chǔ)存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復(fù)凍融,，有效期12個(gè)月,。

【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad系列,、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler,、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀。

【樣本要求】

1. 適用標(biāo)本類型：發(fā)病動(dòng)物血液,、空腸及小腸腸內(nèi)容物及組織臟器(腸道組織,、腸系膜及淋巴結(jié)等)和病毒培養(yǎng)液。

2. 標(biāo)本采集,，方法如下：

(1) 血清：用一次性注射器取靜脈血2-3ml,，轉(zhuǎn)至5ml 的干燥管中，密閉送檢。

(2) 腸內(nèi)容物：無(wú)菌條件下取腸道內(nèi)容物約1g 左右,，置入1ml 含有1.0ml PBS(或生理鹽水)的5ml 離心管中,，立即送檢。

(3) 組織臟器：取發(fā)病動(dòng)物腸道組織及腸系膜淋巴結(jié)等組織約1g,，置一1.5ml的潔凈離心管中,，密閉送檢。

3.應(yīng)避免標(biāo)本間交叉污染,。

4.標(biāo)本收集后可立即檢測(cè),；若不能立即檢測(cè)，可置于2～8℃冷藏過(guò)夜保存,；如需長(zhǎng)期保存,，標(biāo)本應(yīng)凍存于-80℃以下，避免反復(fù)凍融,。

【檢驗(yàn)方法】

1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）

（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實(shí)驗(yàn)所需試劑,，充分融化混勻并瞬時(shí)離心以去除管壁附著液體。

（2）核算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計(jì)算當(dāng)次實(shí)驗(yàn)所需要的各種試劑量,。

n =陰性對(duì)照數(shù)（1T）+陽(yáng)性對(duì)照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)

(3)在無(wú)菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時(shí)離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管,。

2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）

用QIAGEN、Roche公司RNA提取試劑盒提取RNA,，具體操作按照其試劑盒說(shuō)明書(shū)操作,。

3.加樣

在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測(cè)標(biāo)本RNA各5 μl、終體積25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照管則各加5 μL試劑盒自帶的陰性對(duì)照或陽(yáng)性對(duì)照品,，終體積為25 μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時(shí)低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。

4. PCR（PCR擴(kuò)增區(qū)）

（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置，并記錄放置順序,。

（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)進(jìn)行PCR擴(kuò)增,。

注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時(shí)不選ROX校正，設(shè)置淬滅基團(tuán)選擇None,。

【參考值（參考范圍）】

1.試劑盒有效性判定：

（1）陽(yáng)性對(duì)照：有典型S型擴(kuò)增曲線或Ct值≤35,。

（2）陰性對(duì)照：Ct值＞38或無(wú)Ct值，線形為直線或輕微斜線，無(wú)指數(shù)增長(zhǎng)期,。

2.標(biāo)本結(jié)果判定：

（1）陽(yáng)性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期,。

（2）可疑：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時(shí)應(yīng)對(duì)標(biāo)本進(jìn)行重復(fù)檢測(cè),，如重復(fù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長(zhǎng)期，則判定為陽(yáng)性,，否則為陰性。

（3）陰性：標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果Ct值＞38或無(wú)Ct值,。

【檢驗(yàn)結(jié)果的解釋】

【檢驗(yàn)方法的局限性】

1. 當(dāng)檢測(cè)樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會(huì)發(fā)生假陰性的結(jié)果,。

2. 被檢樣本在采集、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中操作方式不當(dāng)容易造成RNA降解而產(chǎn)生假陰性結(jié)果,。

3. 樣本在采集、運(yùn)輸,、儲(chǔ)存以及處理過(guò)程中發(fā)生交叉污染,，則容易得到假陽(yáng)性結(jié)果。

【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為10² Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤5%,。

【注意事項(xiàng)】

1. 整個(gè)檢測(cè)過(guò)程應(yīng)嚴(yán)格按照本說(shuō)明書(shū)要求分別在試劑準(zhǔn)備區(qū)、樣本處理區(qū)和PCR擴(kuò)增區(qū)進(jìn)行操作,，各區(qū)實(shí)驗(yàn)服,、儀器、耗材應(yīng)獨(dú)立使用,，不能混用,；實(shí)驗(yàn)用吸頭采用帶濾芯吸頭；樣本處理區(qū)應(yīng)配有生物安全柜,，樣本處理在生物安全柜中進(jìn)行操作,；三個(gè)區(qū)應(yīng)該配有紫外線殺菌裝置。

2. 為避免RNA降解,，樣本處理過(guò)程應(yīng)在0-4℃條件下操作,，且完成實(shí)驗(yàn)后立即上機(jī)檢測(cè)；樣本處理過(guò)程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過(guò)無(wú)核酶處理,。

3. 每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)該設(shè)置陰,、陽(yáng)性對(duì)照。

4. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時(shí)離心,。

5. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽(yáng)性對(duì)照在di一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū)，并單獨(dú)存放。

6. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進(jìn)行任何標(biāo)記。

7. 儀器擴(kuò)增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說(shuō)明書(shū)相關(guān)要求進(jìn)行設(shè)置,；不同批號(hào)試劑不能混用,。

8. ABI系列熒光定量PCR儀參數(shù)設(shè)置中不選ROX校正，淬滅基因選擇None,。

9. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中產(chǎn)品的廢棄物應(yīng)該進(jìn)行無(wú)害化處理后方可丟棄,。