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牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）如何操作
閱讀：71 發(fā)布時間：2025-4-14牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）如何操作
【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Lumpy skin disease virus Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒
【預(yù)期用途】
本試劑盒利用實時熒光PCR原理，定性檢測LSDV,，對LSDV引起的牛的疫病的診斷和監(jiān)控具有重要指導(dǎo)意義。
【檢驗原理】
本試劑盒針對LSDV高度保守區(qū)域設(shè)計特異性引物和探針,，在反應(yīng)體系中含LSDV基因組模板的情況下,，PCR反應(yīng)得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應(yīng)通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | LSDV PCR反應(yīng)液 | 500 μL×1管 | 1000 μL×1管 |
2 | LSDV 陽性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | LSDV 陰性對照 | 40 μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含牛結(jié)節(jié)性皮膚病靶基因的質(zhì)粒,。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復(fù)凍融，有效期12個月,。
【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler 480,、西安天隆系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。
【樣本要求】
1. 樣品采集及處理
1.1 患畜液體樣品：無菌采集抗凝血或血清,、精液或細(xì)胞懸浮液5 mL。
1.2 患畜組織樣品：包括皮膚,、肺,、脾臟、淋巴結(jié),、肌肉等組織樣品,。2~8℃低溫運輸至實驗室用于檢測。
2. 樣品處理方法
2.1 組織樣品：包括皮膚,、肺,、脾臟、淋巴結(jié),、肌肉等,。取2g-5g組織樣品切成小塊,，加入5ml-10ml預(yù)冷的PBS緩沖液勻漿2min，制成懸液,，反復(fù)凍融3次,，4℃ 5000r/m離心10min，取上清液待檢,；
2.2 液體樣品：抗凝血樣品置離心管中,，掌上離心機離心2 分鐘取上層血漿，待檢,。非抗凝血樣品置離心管中,，待凝固后，掌上離心機離心2 分鐘取上層血清,，待檢,。
2.3 標(biāo)本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存，標(biāo)本應(yīng)凍存于-20℃～-80℃,；
標(biāo)本保存期間應(yīng)避免反復(fù)凍融,。
【檢驗方法】
1. 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當(dāng)次實驗所需要的反應(yīng)數(shù)（n）,，并根據(jù)如下表所示反應(yīng)體系計算當(dāng)次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預(yù)留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應(yīng)液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心,。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應(yīng)管。
（4）蓋緊PCR反應(yīng)管蓋后將PCR反應(yīng)管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。
2.樣本準(zhǔn)備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應(yīng)樣本管中分別加入處理好的待測標(biāo)本DNA各5μl、終體積25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應(yīng)蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。
4. PCR（PCR擴增區(qū)）
反應(yīng)體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集LSDV熒光信號 |
PCR 反應(yīng) 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
58℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
（1）取樣本處理區(qū)準(zhǔn)備好的PCR反應(yīng)管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應(yīng)位置,，并記錄放置順序。
（2）按下表設(shè)置儀器核酸擴增相關(guān)參數(shù)進行PCR擴增,。
注：ABI系列熒光PCR儀在設(shè)置時不選ROX校正,，設(shè)置淬滅基團選擇None。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值,，線形為直線或輕微斜線，無指數(shù)增長期,。
2.標(biāo)本結(jié)果判定：
（1）陽性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期,。
（2）可疑：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi)。此時應(yīng)對標(biāo)本進行重復(fù)檢測,，如重復(fù)實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi),，有明顯指數(shù)增長期，則判定為陽性,，否則為陰性,。
（3）陰性：標(biāo)本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標(biāo)本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陰性（－） | 標(biāo)本中未檢出LSDV |
陽性（＋） | 標(biāo)本中檢測出LSDV |
【檢驗方法的局限性】
1. 當(dāng)檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果,。
2. 本試劑盒僅供標(biāo)本初步篩查使用,，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應(yīng)進一步使用培養(yǎng)法進行確診。
【產(chǎn)品性能指標(biāo)】 產(chǎn)品的最di檢出限為103Copies/mL,，產(chǎn)品CV值≤3%,。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應(yīng)嚴(yán)格按照國家有關(guān)部分頒布的有關(guān)基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理,；
2. 為避免RNA降解,，樣本處理過程應(yīng)在0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應(yīng)經(jīng)過無核酶處理,；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用,，以免污染,；檢測結(jié)束后，應(yīng)立即對工作臺清潔,；
4. 吸取反應(yīng)液時,，應(yīng)盡量避免產(chǎn)生氣泡；上 PCR 儀前,，應(yīng)注意檢查各反應(yīng)管是否蓋緊,，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準(zhǔn)確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應(yīng)該在常溫下充分融化混勻,，并應(yīng)瞬時離心,；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第一次使用前應(yīng)全部轉(zhuǎn)移至標(biāo)本準(zhǔn)備區(qū),，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾,，應(yīng)避免裸手直接接觸PCR反應(yīng)管,，并應(yīng)避免在PCR反應(yīng)管上進行任何標(biāo)記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭,，應(yīng)直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測結(jié)束的PCR 反應(yīng)管，切忌開蓋,，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺及各種實驗用品應(yīng)定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒,；
9.儀器擴增相關(guān)參數(shù)應(yīng)按照本說明書相關(guān)要求進行設(shè)置,；不同批號試劑不能混用；并在有效期內(nèi)使用,。