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豬支原體肺炎實時熒光PCR檢測試劑盒說明
閱讀：1247 發(fā)布時間：2023-2-16【產(chǎn)品名稱】
通用名稱：豬支原體肺炎檢測試劑盒（實時熒光PCR法）
英文名稱：Mycoplasma Hyopneumoniae Detection Kit (Real-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 ＆ 50T/盒
【預期用途】
豬支原體肺炎(Mycoplasmalpneumoniaofswine)是由豬支原體肺炎引起的一種慢性,、接觸性,、呼吸道傳染病，又稱豬地方流行性肺炎,，我國俗稱豬氣喘病,，主要臨診癥狀是咳嗽和氣喘。剖檢變化為肺的尖葉,、心葉和膈葉(主葉)的對稱性實變,。本試劑盒利用實時熒光PCR原理,，主要用于豬支原體肺炎的定性篩查檢測。
【檢驗原理】
本試劑盒針對豬支原體肺炎基因設計特異性引物和探針,，在反應體系中含有豬支原體肺炎 DNA模板的情況下,，PCR反應得以進行并釋放熒光信號。利用儀器對PCR過程中相應通道的信號強度進行實時監(jiān)測和輸出,，實現(xiàn)檢測結(jié)果的定性分析,。
【主要組成成份】
序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
1 | MHP PCR反應液 | 500μL×1管 | 1000μL×1管 |
2 | MHP陽性對照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
3 | MHP陰性對照 | 40μL×1管 | 40 μL×1管 |
4 | 說明書 | 1份 | 1份 |
注：陰性對照為滅菌純水，陽性對照為含豬支原體肺炎靶基因的質(zhì)粒,。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存,，避免反復凍融，有效期12個月,。
【適用儀器】ABI 系列,、Bio-Rad系列、Agilent Stratagene MX系列,、Roche LightCycler R480,、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene系列,、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR儀,。
【樣本要求】
1. 如使用原始標本進行檢測。標本（血液,、痰液,、咽拭子、腦脊液,、菌落,、菌苔等）應為新鮮采集并使用雙蒸滅菌水或滅菌生理鹽水懸浮的原始標本。
2. 如需在增菌后進行PCR檢測,，則應使用選擇性增菌液對原始標本進行增菌,。
3. 標本收集后若不能立即檢測，可置于2～8℃冷藏過夜保存,；如需長期保存,，標本應凍存于-20℃～-80℃。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1）從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,，充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體,。
（2）核算當次實驗所需要的反應數(shù)（n），并根據(jù)如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量,。
n =陰性對照數(shù)（1T）+陽性對照數(shù)（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數(shù)
單反液配制表(每份) | PCR反應液（UNG酶及Taq酶） | 20 μL |
（3）在無菌離心管中加入上述試劑,，充分混勻后瞬時離心。按照20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR反應管。
（4）蓋緊PCR反應管蓋后將PCR反應管轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū),。 剩余試劑放回-20℃以下冰箱冷凍保存,。
2.樣本準備（樣本處理區(qū)）
用QIAGEN、Roche公司DNA提取試劑盒提取DNA,，具體操作按照其試劑盒說明書操作,。
3.加樣
在上述制備好的PCR反應樣本管中分別加入處理好的待測標本DNA各5μl、終體積25μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心,，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加5μL試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品,，終體積為25μl/管,，蓋好PCR反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉(zhuǎn)移到PCR儀器上,。
4.PCR（PCR擴增區(qū)）
（1）取樣本處理區(qū)準備好的PCR反應管,，放置在實時熒光定量PCR儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序,。
（2）按下表設置儀器核酸擴增相關參數(shù)進行PCR擴增,。
反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | FAM通道采集 MHP 熒光信號 |
PCR 反應 條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數(shù) |
UNG處理 | 37℃：2分鐘（min） | 1 | |
預變性 | 95℃：3分鐘（min） | 1 | |
PCR擴增 | 95℃：5秒（s） | 40 | |
55℃：40秒（s） （此階段結(jié)束時采集熒光信號） |
注：ABI系列熒光PCR儀在設置時不選ROX校正，設置淬滅基團選擇None,。
【參考值（參考范圍）】
1.試劑盒有效性判定：
（1）陽性對照：有典型S型擴增曲線或Ct值≤35,。
（2）陰性對照：Ct值＞38或無Ct值，線形為直線或輕微斜線,，無指數(shù)增長期,。
2.標本結(jié)果判定：
（1）陽性：標本檢測結(jié)果Ct值≤35或有明顯指數(shù)增長期。
（2）可疑：標本檢測結(jié)果Ct值在35～38范圍內(nèi),。此時應對標本進行重復檢測,，如重復實驗結(jié)果Ct值仍在35～38范圍內(nèi)，有明顯指數(shù)增長期,，則判定為陽性,，否則為陰性。
（3）陰性：標本檢測結(jié)果Ct值＞38或無Ct值,。
【檢驗結(jié)果的解釋】
通道及檢測結(jié)果 | 標本檢測結(jié)果解釋 |
FAM | |
陰性（－） | 標本中未檢出MHP |
陽性（＋） | 標本中檢測出MHP |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度含量低于本試劑盒的最di檢出限shi可能會發(fā)生假陰性的結(jié)果。
2. 本試劑盒僅供標本初步篩查使用,，對于本試劑盒檢測陽性結(jié)果應進一步使用培養(yǎng)法進行確診,。
【產(chǎn)品性能指標】 產(chǎn)品的最di檢出限為103Copies/mL，產(chǎn)品CV值≤3%,。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室,，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2. 為避免RNA降解，樣本處理過程應在0-4℃條件下操作,，且完成實驗后立即上機檢測,；樣本處理過程中使用的器具耗材應經(jīng)過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用,，不得交叉使用,，以免污染；檢測結(jié)束后,，應立即對工作臺清潔,；
4. 吸取反應液時，應盡量避免產(chǎn)生氣泡,；上 PCR 儀前,，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結(jié)果不準確,；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻,，并應瞬時離心；
6. 試劑盒內(nèi)所配陰性和陽性對照在第yi次使用前應全部轉(zhuǎn)移至標本準備區(qū),，并單獨存放,；
7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸PCR反應管,，并應避免在PCR反應管上進行任何標記,；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內(nèi),，檢測結(jié)束的PCR 反應管,，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄,；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸,、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9. 儀器擴增相關參數(shù)應按照本說明書相關要求進行設置,；不同批號試劑不能混用,；并在有效期內(nèi)使用。