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組織,、細(xì)胞到底該如何裂解？

實(shí)驗(yàn)過程中難免會遇到特殊樣本比如組織和細(xì)胞,，那我們我們又該如何來處理呢,？常見的處理方法就是用RIPA來裂解。如發(fā)現(xiàn) RIPA 有沉淀,，請放室溫半小時(shí)或者常溫水浴使沉淀溶解,。根據(jù)使用量，取每 1ml RIPA 加入 10ul PMSF,，使 PMSF 的終濃度為 1mM,，混勻備用（PMSF 現(xiàn)用現(xiàn)加）。

1,、樣品前處理：

a)對于貼壁細(xì)胞：去除培養(yǎng)液,，用 PBS、生理鹽水或無血清培養(yǎng)液洗一遍,。按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入

150-250 ul 裂解液的比例加入裂解液,。用槍吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸,。

b)對于懸浮細(xì)胞：離心收集細(xì)胞,，按照 6 孔板每孔細(xì)胞量加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液，用手

指輕彈懸浮細(xì)胞以充分裂解,。充分裂解后應(yīng)沒有明顯的細(xì)胞沉淀,。如果細(xì)胞量較多，必需分裝成 5-10×10 5 細(xì)

胞/管,，然后再裂解,。

c)對于組織樣品：把組織剪切成細(xì)小的碎片。按照每 20mg 組織加入 150-250ul 裂解液的比例加入裂解液

(如果裂解不充分可以適當(dāng)添加更多的裂解液,，如果需要高濃度的蛋白樣品,，可以適當(dāng)減少裂解液的用量) 。

用玻璃勻漿器勻漿,，直至充分裂解,。

2、后處理：

將裂解后的樣品 10000-14000g 離心 3-5 分鐘,，取上清,，即可進(jìn)行后續(xù)的蛋白濃度測定、SDS-PAGE,、Western

blotting 和免疫沉淀等操作,。

注意事項(xiàng) ：

1,、 使用本裂解液可以裂解細(xì)胞核，釋放出核蛋白的同時(shí),，也會將基因組一并釋放出來,，造成細(xì)胞裂解液粘

稠，此時(shí)可以直接加入蛋白上樣緩沖液煮沸再離心,，離心后直接上樣電泳,；若想測定濃度，可入加少量 SDS

（1%）,，煮沸后離心測濃度,。

2、 本系列蛋白提取試劑所提取的蛋白由于含有去污劑,，所以不適合使用 Bradford 蛋白濃度測定試劑盒,，請

選擇 BCA 法或者 Lowry 法檢測蛋白濃度。

3,、 如果需要檢測和基因組結(jié)合特別緊密的蛋白,，則可以通過超聲處理打碎打散粘稠狀物，隨后離心取上清

用于后續(xù)實(shí)驗(yàn),。