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詳談各種酶活檢測方法
閱讀：5605 發(fā)布時間：2019-3-5詳談各種酶活檢測方法
通常酶制劑活性的檢測是采用實(shí)驗(yàn)室分析手段來進(jìn)行評價,，它可以用來篩選酶制劑,、確定復(fù)合酶制劑的zui佳組方及確定產(chǎn)品的zui佳添加量等，酶制劑實(shí)驗(yàn)室評價技術(shù)是目前飼料廠家應(yīng)用zui為廣泛的一種方法,。其操作相對簡單,，檢測所用時間短，便于生產(chǎn)實(shí)踐應(yīng)用,。酶活測定結(jié)果雖不能*反映酶的使用效果,，但通過檢測至少可以避免使用劣質(zhì)的酶制劑,。我國飼料工業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中已經(jīng)確立了飼用植酸酶（GB/T 18634）,、纖維素酶（NY/T912）、β-葡聚糖酶（NY/T 911）的測定方法,。另外,，許多企事業(yè)單位為了生產(chǎn)研究的需要也制定了很多用于各種酶制劑活力的測定方法。目前測定酶制劑活性的方法主要有：
1, 比色法
比色法是以反應(yīng)生成有色化合物的顯色反應(yīng)為基礎(chǔ),，通過比較或測量有色物質(zhì)溶液顏色深度來確定待測組分含量的方法,，根據(jù)原理不同可分為還原糖法和色原底物法。
2, 還原糖法 這種方法是通過酶作用于化學(xué)合成或從自然界提取出來的底物來進(jìn)行測定的,。非淀粉多糖酶與底物在特定的條件（溫度,、pH值和底物濃度）下反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物為還原糖,，在與顯色劑反應(yīng)后,，通過比色確定還原糖的生成量，同時制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,。酶的活性表示為單位時間產(chǎn)生一定濃度的產(chǎn)物所需要的酶量（mg 或mL）,。該法可適用于大部分酶活力的測定，如淀粉酶,、蛋白酶,、脂肪酶、植酸酶,、木聚糖酶,、果膠酶、β-葡聚糖酶,、纖維素酶等的測定,。根據(jù)顯色劑的不同又可分為DNS 法、釩鉬酸銨法和地衣酚法,。其中DNS 法由于操作簡單,、顯色穩(wěn)定，是目前眾多實(shí)驗(yàn)室和飼料企業(yè)在測定非淀粉多糖酶時應(yīng)用zui多的測定方法。
3, 色原底物法 原理是利用人工合成的含色原基團(tuán)的底物在酶的作用下釋放出有色物質(zhì),，利用分光光度計比色測定有色物質(zhì)的含量計算酶活,。如木聚糖酶活力的測定。該法操作簡單,、重現(xiàn)性好,，但酶作用于合成底物與天然底物的效果有一定區(qū)別，用合成底物測定的酶活并不能代表酶制劑在應(yīng)用于天然飼料時所能發(fā)揮的酶活大小,。
4, 黏度法
這種方法是根據(jù)酶能夠降低一定濃度的標(biāo)準(zhǔn)底物（控制pH值,、溫度等條件）的黏度的能力來確定酶的活性。利用的底物主要有化學(xué)合成的底物（如CMC 用于纖維素酶的測定） 和自然提取的底物（如小麥阿拉伯木聚糖用于木聚糖酶的測定）,。測定的酶的活性值是通過與同時測定的標(biāo)準(zhǔn)酶活性的比較,，來確定酶的活性。該法可用于木聚糖酶,、β-甘露聚糖酶,、β-葡聚糖酶等酶活測定。這種方法的特點(diǎn)是通過降低底物的粘度來反映酶的活性,，這也正是酶在體內(nèi)起作用的重要特征,。該法雖然靈敏度較高，但重現(xiàn)性差,，操作復(fù)雜費(fèi)時,，應(yīng)用難于普及。
5, 免疫學(xué)法
用于酶活性分析的免疫學(xué)法包括ELISA 法和免疫凝膠擴(kuò)散法,。這兩種方法是根據(jù)酶與抗體之間發(fā)生反應(yīng),，然后ELISA 法通過第二步反應(yīng)，凝膠擴(kuò)散法則通過印染過程來確定酶的活性,。
這些方法非常靈敏,，能夠檢測到極低水平的酶蛋白。但它們的缺點(diǎn)是對于每個產(chǎn)品的酶需要特殊的抗體,，另外抗體能夠與非酶蛋白質(zhì)發(fā)生反應(yīng),。由于抗體本身所用的蛋白質(zhì)是特定的，因此,，由不同生產(chǎn)者生產(chǎn)的同種類型的酶之間是沒有交叉性的,。另外，采用實(shí)驗(yàn)動物的敏感性也值得探討,。
6, 凝膠擴(kuò)散法
這種方法是將酶作用的底物與某種凝膠混合后倒入培養(yǎng)皿中,，凝固之后，在凝膠上切開一條鑿,，倒入標(biāo)準(zhǔn)酶液和測試酶液,。培養(yǎng)一定時間后，在切開的凝膠周圍能夠看到水解區(qū)域，區(qū)域的大小與酶的含量成正比,。在某些情況下,，還可以再加入其他試劑來顯示水解的區(qū)域。如木聚糖酶活力的測定,。 這種方法雖然簡單,，但培養(yǎng)時間長。因?yàn)檫@種方法是根據(jù)區(qū)域的大小來確定酶的活性,，所以其準(zhǔn)確性要低于其他非擴(kuò)散的方法,。
7, 比濁法
以酵母或酵母細(xì)胞壁在緩沖溶液中的濁度或吸光度的降低來表示酶活力，如β-葡聚糖酶活力的測定,。
8,體外模擬消化技術(shù)
酶活測定畢竟不能反映外源酶在機(jī)體內(nèi)真實(shí)的作用效果,，因此，對于體外法評定飼料營養(yǎng)價值的研究不斷增加,。體外法評定飼料營養(yǎng)價值是通過模擬消化道內(nèi)溫度,、pH、消化酶分泌,、胃腸運(yùn)動和養(yǎng)分吸收等參數(shù)，在體外建立一套與畜禽消化道內(nèi)環(huán)境接近的操作程序,，對飼料及酶制劑進(jìn)行營養(yǎng)價值預(yù)測和評定,。常用的體外模擬消化技術(shù)包括：①胃蛋白酶—胰酶法；②胃蛋白酶—小腸液法,；③胃蛋白酶—胰酶—瘤胃液法,；④胃蛋白酶—胰酶—碳水化合物酶法。
由于不同的飼料用酶是不同的微生物通過發(fā)酵過程產(chǎn)生的,，酶產(chǎn)品的酶學(xué)性質(zhì)差別較大,。并且各種微生物所分泌的酶的zui佳pH 值、溫度和對底物的親和性都不相同,。而目前,，飼用酶除植酸酶、纖維素酶,、木聚糖酶和β-葡聚糖酶有正式頒布的國標(biāo)或行標(biāo)酶活測定方法外,，其他飼用酶制劑目前都還沒有一個統(tǒng)一的定義及檢測標(biāo)準(zhǔn)。因此,，飼料廠家在比較不同廠家的酶制劑時,，在沒有統(tǒng)一的測定方法情況下，應(yīng)首先確定自己認(rèn)可的檢測方法,，然后在*相同的測定條件進(jìn)行檢測,，這樣得出的結(jié)論才具有可比性。