^{_{深芬儀器非洲豬瘟檢測(cè)儀使用說明書}}

^{_{l 本試劑盒用于檢測(cè)血清非洲豬瘟（ASF）存在與否,。}}

^{_{l 有效期：6個(gè)月}}

^{_{l 保存條件：2-8℃}}

^{_{l 本試劑盒僅供科研使用,，不得用于臨床診斷}}

^{_{檢測(cè)前準(zhǔn)備工作：}}

^{_{1. 請(qǐng)?zhí)崆?0分鐘從冰箱中取出試劑盒，平衡至室溫,。}}

^{_{2. 從冰箱中取出的濃縮洗滌液可能有結(jié)晶,，屬于正常現(xiàn)象,；放置室溫,，輕搖均勻，待結(jié)晶*溶解后再配置洗滌液,?？蓪?0ml濃縮洗滌液用蒸餾水或去離子水稀釋配置成400ml工作濃度的洗滌液，未用完的放回4℃}}

^{_{3. 20×洗滌緩沖液的稀釋：蒸餾水按1：20稀釋,，即1份20×洗滌緩沖液加19份蒸餾水,。}}

^{_{實(shí)驗(yàn)所需自備試驗(yàn)器材：}}

^{_{1. 檢測(cè)儀（450nm）}}

^{_{2. 高精度加樣器及槍頭：0.5-10uL、2-20uL,、20-200uL,、200-1000uL}}

^{_{3. 37℃恒溫箱或水浴鍋}}

^{_{4. 蒸餾水或去離子水}}

^{_{試劑盒組成：}}

^_備注：

^{_{1.（96T/48T）打開包裝后請(qǐng)及時(shí)檢查所有物品是否齊全。}}

^{_{實(shí)驗(yàn)原理：}}

  ^{_{試劑盒采用雙抗一步夾心法酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）,。往預(yù)先包被非洲豬瘟抗體的包被微孔中,，依次加入標(biāo)本、HRP標(biāo)記的檢測(cè)抗原,，經(jīng)過溫育并*洗滌,。用底物TMB顯色，TMB在過氧化物酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍(lán)色,，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成終的黃色,。用酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD 值）,，與CUT OFF值相比較，從而判定標(biāo)本中非洲豬瘟（ASF）的存在與否,。}}

^{_{樣本處理及要求：}}

^{_{1. 血清：室溫血液自然凝固10-20分鐘,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如出現(xiàn)沉淀,，應(yīng)再次離心。}}

^{_{2. 血漿：應(yīng)根據(jù)標(biāo)本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑,，混合10-20分鐘后,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細(xì)收集上清,，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)該再次離心。}}

^{_{3. 尿液：用無菌管收集,，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清，保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。胸腹水、腦脊液參照實(shí)行,。}}

^{_{4. 細(xì)胞培養(yǎng)上清：檢測(cè)分泌性的成份時(shí),，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清,。檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的成份時(shí)，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細(xì)胞懸液,，細(xì)胞濃度達(dá)到100萬/ml左右,。通過反復(fù)凍融，以使細(xì)胞破壞并放出細(xì)胞內(nèi)成份,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。保存過程中如有沉淀形成,，應(yīng)再次離心,。5. 組織標(biāo)本：切割標(biāo)本后，稱取重量,。加入一定量的PBS,，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆?。?biāo)本融化后仍然保持2-8℃的溫度,。加入一定量的PBS（PH7.4）,，用手工或勻漿器將標(biāo)本勻漿充分,。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）,。仔細(xì)收集上清。分裝后一份待檢測(cè),，其余冷凍備用,。}}

^{_{6. 標(biāo)本采集后盡早進(jìn)行提取，提取按相關(guān)文獻(xiàn)進(jìn)行,，提取后應(yīng)盡快進(jìn)行實(shí)驗(yàn),。若不能馬上進(jìn)行試驗(yàn)，可將標(biāo)本放于-20℃保存,，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.}}

^{_{7. 不能檢測(cè)含NaN3的樣品,，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。}}

^{_{注意事項(xiàng)：}}

^{_{1. 嚴(yán)格按照規(guī)定的時(shí)間和溫度進(jìn)行溫育以保證準(zhǔn)確結(jié)果,。所有試劑都必須在使用前達(dá)到室溫20-25℃,。使用后立即冷藏保存試劑。}}

^{_{2. 洗板不正確可以導(dǎo)致不準(zhǔn)確的結(jié)果,。在加入底物前確保盡量吸干孔內(nèi)液體,。溫育過程中不要讓微孔干燥掉。}}

^{_{3. 消除板底殘留的液體和手指印,，否則影響OD值,。}}

^{_{4. 底物顯色液應(yīng)呈無色或很淺的顏色，已經(jīng)變藍(lán)的底物液不能使用,。}}

^{_{5. 避免試劑和標(biāo)本的交叉污染以免造成錯(cuò)誤結(jié)果,。}}

^{_{6. 在儲(chǔ)存和溫育時(shí)避免強(qiáng)光直接照射。}}

^{_{7. 平衡至室溫后再打開密封袋以防水滴凝聚在冷板條上,。}}

^{_{8. 任何反應(yīng)試劑不能接觸漂白溶劑或漂白溶劑所散發(fā)的強(qiáng)烈氣體,。任何漂白成分都會(huì)破壞試劑盒中反應(yīng)試劑的生物活性。}}

^{_{9. 不能使用過期產(chǎn)品,不同批號(hào)組分不得混用,。}}

^{_{10. 如果可能傳播疾病,，所有的樣品都應(yīng)管理好，按照規(guī)定的程序處理樣品和檢測(cè)裝置,。}}

^{_{操作步驟：}}

^{_{1.  從室溫平衡20min后的鋁箔袋中取出所需板條,，剩余板條用自封袋密封放回4℃。}}

^{_{2.  設(shè)置陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔,，陰、陽(yáng)性對(duì)照孔中加入陰性對(duì)照,、陽(yáng)性對(duì)照各50μL,；}}

^{_{3.  待測(cè)樣本孔加待測(cè)樣本10μL,，樣本稀釋液40μL；}}

^{_{4.  隨后陰,、陽(yáng)性對(duì)照孔和樣本孔中每孔加入辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗原100μL,，用封板膜封住反應(yīng)孔，37℃水浴鍋或恒溫箱溫育60min,。}}

^{_{5.  棄去液體,，吸水紙上拍干，每孔加滿洗滌液,，靜置1min,，甩去洗滌液，吸水紙上拍干,，如此重復(fù)洗板5次（也可用洗板機(jī)洗板）,。}}

^{_{6.  每孔加入底物A、B各50μL,，37℃避光水浴鍋孵育15min,。}}

^{_{7.  每孔加入終止液50μL，15min內(nèi),，在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的OD值,。}}

^{_{計(jì)算：}}

^{_{1.  試驗(yàn)有效性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00；}}

      ^{_{陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15,。}}

^{_{2.  臨界值（Cut off）計(jì)算：臨界值=陰性對(duì)照孔平均值+0.15}}

^{_{3.  陰性判斷：樣品OD值＜臨界值（Cut off）,，樣品為陰性}}

^{_{4.  陽(yáng)性判斷：樣品OD值＞臨界值（Cut off），樣品為陽(yáng)性}}

^{_{深芬儀器非洲豬瘟檢測(cè)儀試劑盒性能：}}

^{_{1.  準(zhǔn)確性：陽(yáng)性對(duì)照孔OD值平均值≥1.00,；陰性對(duì)照孔OD值平均值≤0.15,，說明試驗(yàn)結(jié)果有效。}}

^{_{2.  特異性：不與其它可溶性結(jié)構(gòu)類似物交叉反應(yīng),。}}

^{_{3.  重復(fù)性：板內(nèi),、板間變異系數(shù)均小于15%。}}

^{_{4.  貯藏：2-8℃,，避光防潮保存,。}}