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熒光檢測(cè)知識(shí)普及原理
閱讀：2799 發(fā)布時(shí)間：2021-2-4很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都要檢測(cè)熒光,，為方便大家選擇合適的方法,，在此簡(jiǎn)單說一下各種熒光檢測(cè)方法的特點(diǎn)。不足的地方,，歡迎大家補(bǔ)充：
1,、流式，優(yōu)點(diǎn)是速度快,，非常適合做大數(shù)量統(tǒng)計(jì),，且樣品只被檢測(cè)一次，*不用擔(dān)心熒光淬滅的問題,。缺點(diǎn)是只能檢測(cè)熒光的有無,、強(qiáng)度大小，無法提供空間定位信息,，無法做熒光定位變化的實(shí)驗(yàn),；由于樣品只被檢測(cè)一次，因此無法對(duì)同一個(gè)樣品進(jìn)行連續(xù)觀察,。例如,，做膜蛋白定位時(shí)會(huì)得到這么一個(gè)結(jié)果——用流式可以檢測(cè)出信號(hào)，但是用顯微鏡卻看不到東西,，排除儀器和濾光片選擇問題,，很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標(biāo)記造成流式的假陽性結(jié)果。
2,、熒光顯微鏡,，剛好與流式互補(bǔ)，可很好地進(jìn)行空間觀察,，判斷目標(biāo)蛋白的定位,，但是不適合做大流量檢測(cè)，估計(jì)沒人能經(jīng)得起時(shí)間的考驗(yàn),。有不同倍率的物鏡選擇,，可以使用高倍物鏡看精細(xì)結(jié)構(gòu)，或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計(jì)。與之搭配的CCD和軟件,，是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵,。尤其是CCD，從那么多商品里選一款合適的不容易,，需要了解很多知識(shí)否則只能聽別人忽悠,。
3、共聚焦,，熒光顯微鏡的升級(jí)產(chǎn)品,，具有很好的光學(xué)層切效果，能得到很好三維定位信息,。但是,，如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照，取得一張好看的圖片,，就讓人覺得可惜了,。共聚焦基本都是全自動(dòng)系統(tǒng)，可隨意定義照明區(qū)域,、選擇多個(gè)熒光通路和設(shè)定定時(shí)取圖,，所以，做Time-laps,、FRAP和FRET有其獨(dú)到的優(yōu)勢(shì),。另外，4Pi和STED又是其中的極,，具有超高的空間分辨率,，只是使用不方便，未必適合做生物實(shí)驗(yàn),。
4,、全內(nèi)反射，熒光顯微鏡的另一種升級(jí)產(chǎn)品,，屬于近場(chǎng)光學(xué)范疇,，只適合且合做膜研究，無法看到胞內(nèi)信息,。也是用CCD成像,，但是對(duì)CCD的要求更高——個(gè)人甚至覺得對(duì)CCD的要求是沒有上限的。
5,、雙光子，另一種共聚焦,，因使用長波激發(fā)熒光,，故能做深層檢測(cè)（突破共聚焦的100微米極限），典型的應(yīng)用是觀察活體腦組織,。巨貴無比,，國內(nèi)沒有幾臺(tái),，能用上的人不多——就不說了。
6,、新推出的高內(nèi)涵藥篩系統(tǒng),，流式和顯微鏡的雜合體，使用電動(dòng)載物臺(tái),，可以自動(dòng)地按預(yù)定程序完成實(shí)驗(yàn),，可做大流量檢測(cè)（雖然速度慢點(diǎn)），而且有成像能力,，可以判斷定位,。前段時(shí)間，國內(nèi)哪裝了一臺(tái),，很多人在吹,，但我實(shí)在不知道其中的好處——任何一臺(tái)帶電動(dòng)載物臺(tái)的顯微鏡都可以達(dá)到相似的效果，只要軟件支持——估計(jì)有人賺大發(fā)啦,！
從以上的簡(jiǎn)介可以看出,，只要是熒光樣品，就應(yīng)該都可使用以上儀器檢測(cè)（只用TIRF受一些限制）,。但是實(shí)際應(yīng)用時(shí),，大家可能會(huì)碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡，但是無法使用共聚焦,。為什么,？解釋一下：
首先，熒光檢測(cè)必須有激發(fā)光照明,，染料被特定波長的光照射以后才能發(fā)射熒光,。激發(fā)光源有兩種：1）白光（汞燈、氙燈等）,，然后通過濾光片選擇只通過特定波長的光,。如檢測(cè)GFP時(shí)，大家能看到藍(lán)光照射在樣品上,，因?yàn)镚FP的激發(fā)條件是488nm 光,。但是有一點(diǎn)，顯微鏡不可能裝無限多的濾光片,，所以選擇是有限的,。2）激光，普通的激光器只能發(fā)射特定波長的光,，且數(shù)量有限,，常見的是405、488、514,、543,、633等，所以可使用的染料也是有限,。因此,，大家判定儀器能否滿足你實(shí)驗(yàn)要求，務(wù)必先看看激發(fā)條件是否合適,。
其次,，在光檢測(cè)器（PMT、CCD)前還有一塊濾光片,，作用是反射樣品各種散射光,，只通過特定波長的熒光，提高信噪比,，得到干凈的背景,。因此，這塊濾光片也決定了儀器能否滿足你的實(shí)驗(yàn)要求（不用太擔(dān)心,，這個(gè)一般和激發(fā)濾光片配套,，不會(huì)有太多問題）。而在光譜型共聚焦里,，使用的是棱鏡或衍射光柵分光,，可以選擇通過任意需要的波段。這對(duì)使用量子點(diǎn)做標(biāo)記的同學(xué)特別有好處,！