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熒光檢測知識普及原理
閱讀：3030 發(fā)布時間：2021-2-4很多細(xì)胞實(shí)驗(yàn)都要檢測熒光,，為方便大家選擇合適的方法，在此簡單說一下各種熒光檢測方法的特點(diǎn),。不足的地方,，歡迎大家補(bǔ)充：
1、流式,，優(yōu)點(diǎn)是速度快,，非常適合做大數(shù)量統(tǒng)計(jì)，且樣品只被檢測一次,，*不用擔(dān)心熒光淬滅的問題,。缺點(diǎn)是只能檢測熒光的有無、強(qiáng)度大小,，無法提供空間定位信息,，無法做熒光定位變化的實(shí)驗(yàn)；由于樣品只被檢測一次,，因此無法對同一個樣品進(jìn)行連續(xù)觀察,。例如，做膜蛋白定位時會得到這么一個結(jié)果——用流式可以檢測出信號,，但是用顯微鏡卻看不到東西,，排除儀器和濾光片選擇問題，很可能是核的自發(fā)熒光或非特異標(biāo)記造成流式的假陽性結(jié)果,。
2,、熒光顯微鏡，剛好與流式互補(bǔ),，可很好地進(jìn)行空間觀察,，判斷目標(biāo)蛋白的定位，但是不適合做大流量檢測,，估計(jì)沒人能經(jīng)得起時間的考驗(yàn),。有不同倍率的物鏡選擇,，可以使用高倍物鏡看精細(xì)結(jié)構(gòu)，或用小倍率物鏡做少量統(tǒng)計(jì),。與之搭配的CCD和軟件,，是系統(tǒng)能否發(fā)揮性能的關(guān)鍵。尤其是CCD,，從那么多商品里選一款合適的不容易,，需要了解很多知識否則只能聽別人忽悠。
3,、共聚焦,，熒光顯微鏡的升級產(chǎn)品，具有很好的光學(xué)層切效果,，能得到很好三維定位信息,。但是，如果使用共聚焦的目的僅僅是為你的樣品拍一張靚照,，取得一張好看的圖片,，就讓人覺得可惜了。共聚焦基本都是全自動系統(tǒng),，可隨意定義照明區(qū)域,、選擇多個熒光通路和設(shè)定定時取圖，所以,，做Time-laps,、FRAP和FRET有其獨(dú)到的優(yōu)勢。另外,，4Pi和STED又是其中的極,，具有超高的空間分辨率，只是使用不方便,，未必適合做生物實(shí)驗(yàn),。
4、全內(nèi)反射,，熒光顯微鏡的另一種升級產(chǎn)品,，屬于近場光學(xué)范疇，只適合且合做膜研究,，無法看到胞內(nèi)信息,。也是用CCD成像，但是對CCD的要求更高——個人甚至覺得對CCD的要求是沒有上限的,。
5,、雙光子，另一種共聚焦，因使用長波激發(fā)熒光,，故能做深層檢測（突破共聚焦的100微米極限）,，典型的應(yīng)用是觀察活體腦組織,。巨貴無比,，國內(nèi)沒有幾臺，能用上的人不多——就不說了,。
6,、新推出的高內(nèi)涵藥篩系統(tǒng)，流式和顯微鏡的雜合體,，使用電動載物臺,，可以自動地按預(yù)定程序完成實(shí)驗(yàn)，可做大流量檢測（雖然速度慢點(diǎn)）,，而且有成像能力,，可以判斷定位。前段時間,，國內(nèi)哪裝了一臺,，很多人在吹，但我實(shí)在不知道其中的好處——任何一臺帶電動載物臺的顯微鏡都可以達(dá)到相似的效果,，只要軟件支持——估計(jì)有人賺大發(fā)啦,！
從以上的簡介可以看出，只要是熒光樣品,，就應(yīng)該都可使用以上儀器檢測（只用TIRF受一些限制）,。但是實(shí)際應(yīng)用時，大家可能會碰到某些樣品可以使用流式和顯微鏡,，但是無法使用共聚焦,。為什么？解釋一下：
首先,，熒光檢測必須有激發(fā)光照明,，染料被特定波長的光照射以后才能發(fā)射熒光。激發(fā)光源有兩種：1）白光（汞燈,、氙燈等）,，然后通過濾光片選擇只通過特定波長的光。如檢測GFP時,，大家能看到藍(lán)光照射在樣品上,，因?yàn)镚FP的激發(fā)條件是488nm 光。但是有一點(diǎn),，顯微鏡不可能裝無限多的濾光片,，所以選擇是有限的。2）激光，普通的激光器只能發(fā)射特定波長的光,，且數(shù)量有限,，常見的是405、488,、514,、543、633等,，所以可使用的染料也是有限,。因此，大家判定儀器能否滿足你實(shí)驗(yàn)要求,，務(wù)必先看看激發(fā)條件是否合適,。
其次，在光檢測器（PMT,、CCD)前還有一塊濾光片,，作用是反射樣品各種散射光，只通過特定波長的熒光,，提高信噪比,，得到干凈的背景。因此,，這塊濾光片也決定了儀器能否滿足你的實(shí)驗(yàn)要求（不用太擔(dān)心,，這個一般和激發(fā)濾光片配套，不會有太多問題）,。而在光譜型共聚焦里,，使用的是棱鏡或衍射光柵分光，可以選擇通過任意需要的波段,。這對使用量子點(diǎn)做標(biāo)記的同學(xué)特別有好處,！