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         聚合酶鏈反應簡稱PCR(Polymerase Chain Reaction),，是以DNA半保留復制機制為基礎,，發(fā)展出的體外酶促合成、擴增特定核酸片段的一種方法,。PCR是一種非常強大的技術,，可以通過一種非常簡單但是高效的方法來復制DNA，它可看作是生物體外的特殊DNA復制,，PCR的最大特點是能將微量的DNA大幅增加,。DNA復制是很多研究的基礎，例如,，當我們對RNA進行測序時,，必須先將RNA轉化為DNA，并進行大量復制,。在對于某個人進行基因組測序時,，我們不能對于某個細胞或者單個分子進行測序。測序的基礎要求擁有大量的相同的DNA分子拷貝,，因此,，DNA復制是做生物研究中的基礎工具。那么怎么獲取這么多拷貝呢,？PCR正是一個復印機一般的存在,，利用DNA的幾個特性，成為批量復制DNA的決佳方法。

     

      PCR原理是DNA分子兩條單鏈以雙螺旋結構結成,，DNA兩條鏈擁有自行粘附的特性,，A與T配對，C與G配對,，DNA粘附特性是PCR的核心原理,。同時DNA復制時也是具有方向性的，DNA序列的開始端稱為5‘端,，末端稱為3’端,。

      在復制時，需要加入一種叫做引物（primers）的東西,。可以將引物理解為一個短序列,，下圖中紅色的部分就是引物,。引物通常15到20個堿基，可以短一些,，也可以長一些,。但是必須和我們想合成的DNA片段成互補關系。將引物與DNA鏈混合時,，會自動粘在上面,，因為他們是互補的。引物獲得可以從公司訂購,，后續(xù)有機會我們也會分享引物設計方法,。下面了解PCR反應DNA體外復制的所需條件如下：

一、模板和底物

DNA復制是模板依賴性的,，必須以親代DNA鏈作為模板,，親代DNA的兩股鏈解開后，可分別作為模板進行復制,。同時,，DNA復制需要以四種脫氧核糖核苷酸，即dATP,、dGTP,、dCTP、dTTP,，為底物合成子代DNA,。
在體外進行DNA復制時，模板和底物均可通過人工添加解決,。

二,、引物

DNA聚合酶必須以一段具有3’端自由羥基（3’-OH）的RNA作為引物，才能開始合成子代DNA鏈,。

在體外進行DNA復制時,，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作為引物,，該引物序列與進行擴增的目的核酸片段互補匹配，從而開始目的片段的擴增,。

因為引物的堿基序列需要與目的片段相匹配,，在合成引物之前，必須首先已知目的片段的堿基序列,，至少也要知道目的片段的部分序列,，從而確定合成引物的堿基序列。

三,、模板雙鏈的解旋

在DNA的半保留復制機制中,，雙鏈DNA的解旋是在拓撲異構酶和解鏈酶的作用下完成的，該過程需要拓撲異構酶識別DNA的復制起點才能開啟,，而體外擴增特定的核酸片段只需要特異性的復制目的核酸片段,，因而需要一種方式使得模板DNA解旋為單鏈DNA，之后在使之與引物結合,，從而特異性的擴增目的核酸片段,。

三、DNA的變性

DNA變性是指核酸雙螺旋結構中堿基對的氫鍵斷裂,，使得雙鏈變?yōu)閱捂湹倪^程,。

對雙鏈DNA進行加熱可以使其發(fā)生變性，當溫度升高到一定高度時,，DNA在260nm處的吸光度會突然發(fā)生明顯的上升,，并達到最大值，之后溫度繼續(xù)上升,，其吸光度也不會發(fā)生明顯變化,，若以溫度對DNA溶液的260nm吸光度做圖，會得到典型的DNA變性S型曲線,。

DNA的變性是在一個很窄的溫度范圍內發(fā)生的,，通常將核酸加熱變性過程中，紫外光吸收值達到最大值50%時的溫度稱為核酸的熔解溫度 (Tm, melting temperature),。

1. 特定核酸分子的Tm值與其G+C含量成正相關,，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；

2. Tm值的大小還與核酸分子的長度有關,，核酸分子越長,，Tm值越大；

3. 粒子強度越高,，熔解溫度越高,，熔解溫度范圍越窄。

四、DNA的復性

加熱變性的DNA在緩慢冷卻后可以由單鏈恢復為雙鏈結構,，這一過程稱為DNA的復性,，也稱為“退火 (annealing)"。

當溫度降低至比變性DNA的Tm低25℃時,，其復性效果*佳,，越遠離此溫度，復性效果越差,。

因此,，可以利用此特性，在加熱使模板DNA變性后,，將溫度降低至特定溫度,，從而使所加引物與模板DNA復性結合，進而能夠對引物所規(guī)定的核酸片段進行特異性的擴增,。

五,、DNA聚合酶

為了使模板中特定的核酸片段進行擴增，在模板與引物結合后,，需要有DNA聚合酶的參與，但是由于DNA變性和復性過程的溫度較高,，普通的DNA聚合酶在此過程中會由于溫度過高而失活,。

         科學家為了解決該問題，從水生棲熱菌 (Thermus Aquaticus) 中分離出了具有熱穩(wěn)定性的DNA聚合酶,，該酶可以耐受90℃以上的高溫而不失活,。