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酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 操作步驟詳解
閱讀：306 發(fā)布時間：2025-2-18酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面,，使酶標記的抗原抗體反應在固相表面進行的技術,。該技術可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速,、靈敏,、簡便、載體易于標準化等優(yōu)點,。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結合原理,，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法，酶聯(lián)免疫吸附分析是免疫分析的一種,，分三個部分組成：免疫識別,，信號輸出和數(shù)據(jù)處理。保證ELISA檢測結果準確可靠的必要條件有優(yōu)質(zhì)的試劑,，良好的儀器和正確的操作,。嚴格遵照使用說明規(guī)定操作，必能得出準確的結果,。
1. 標本的采取和保存
可用作 ELISA測定的標本十分廣泛,，體液（如血清）、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液,、糞便）等均可作標本以測定其中某種抗體或抗原成份,。有些標本可直接進行測定（如血清、尿液）,，有些則需經(jīng)預處理（如糞便和某些分泌物）,。大部分ELISA檢測以血清標本為主。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,，其他成份均同等于血清,。制備血漿標本需借助于抗凝劑，而血清標本只要待血清自然凝固,、xue塊收縮后即可取得,。血清標本可按常規(guī)方法采集，應注意避免溶血,，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì),，以HRP為標記的ELISA測定中，溶血標本可能會增加非特異性顯色,。
血清標本宜在新鮮時檢測,。如有細菌污染，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會產(chǎn)生假陽性反應,。一般說來,，在3天內(nèi)測定的血清標本可放置于4℃，超過一周測定的需低溫冰存,。凍結血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮，分布不均,，應充分混勻宜輕緩,，避免氣泡，可上下顛倒混和,，不要在混勻器上強烈振蕩,。混濁或有沉淀的血清標本應先離心或過濾,，澄清后再檢測,。反復凍融會使抗體效價跌落，所以測抗體的血清標本如需保存作多次檢測,，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應注意無菌操作，也可加入適當防腐劑,。
2. 試劑的準備
按試劑盒說明書的要求準備實驗中需用的試劑,。 ELISA中用的蒸餾水或去離子水，包括用于洗滌的,，應為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應用pH計測量較正。從冰箱中取出的試驗用試劑應待溫度與室溫平衡后使用,。試劑盒中本次試驗不需用的部分應及時放回冰箱保存,。
3. 加樣
在 ELISA中一般有3次加樣步聚，即加標本,，加酶結合物，加底物,。加樣時應將所加物加在ELISA板孔的底部,，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。加標本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標本應更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣,。如測定需用稀釋的血清（如間接法 ELISA）,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣,。也可在板孔中加入稀釋液，再在其中加入血清標本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和,。加酶結合物應用液和底物應用液時可用定量多道加液器，使加液過程迅速完成,。
4. 保溫
在 ELISA中一般有兩次抗原抗體反應,，即加標本和加酶結合物后?？乖贵w反應的完成需要有一定的溫度和時間,，這一保溫過程稱為溫育(incubation)或孵育。
ELISA屬固相免疫測定,，抗原,、抗體的結合只在固相表面上發(fā)生。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標本,，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結合的機會，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程,，因此需經(jīng)擴散才能達到反應的終點。在其后加入的酶標記抗體與固相抗原的結合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應總是需要一定時間的溫育,。
溫育常采用的溫度有 43℃、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等,。37℃是實驗室中常用的保溫溫度，也是大多數(shù)抗原抗體結合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應動力學研究時,，實驗表明，兩次抗原抗體反應一般在37℃經(jīng)1-2小時,，產(chǎn)物的生成可達頂,。為加速反應，可提高反應的溫度,，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應4℃更為徹di,，在放射免疫測定中多使反應在冰箱中過夜，以形成最多的沉淀。但因所需時間太長,，在ELISA中一般不予采用,。
5. 洗滌
洗滌在 ELISA過程中雖不是一個反應步驟，但卻也決定著實驗的成敗,。ELISA就是靠洗滌來達到分離游離的和結合的酶標記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結合的物質(zhì)，以及在反應過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯y(tǒng)i烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，而在洗滌時又應把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來?？梢哉f在ELISA操作中,，洗滌是最主要的關鍵技術，應引起操作者的高度重視,，操作者應嚴格按要求洗滌,，不得馬虎。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外,，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種,，過程如下：
(1) 浸泡式： a.吸干或甩干孔內(nèi)反應液；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后,，即甩去）,；c.浸泡，即將洗滌液注滿板孔,，放置1-2分鐘,，間歇搖動，浸泡時間不可隨意縮短,；d.吸干孔內(nèi)液體,。吸干應徹di，可用水泵或真空泵抽吸,，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干,；e.重復操作c和d，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）,。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法,。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯y(tǒng)i烯載體與蛋白質(zhì)的結合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團,，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結合，并借助于親水基團和水分子的結合作用，使蛋白質(zhì)回復到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體,。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫 20，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度。
(2) 流水沖洗式：流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水,。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗,，持續(xù)沖洗 2分鐘后,，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘,，吸干即可,。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴,，其洗滌效果更為徹di,，且也簡便、快速,。已有實驗表明,，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時設法加大水流量或加大水壓,，讓水流沖擊板孔表面,，洗滌效果更佳。
6. 顯色和比色
(1) 顯色
顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應,，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物,。反應的溫度和時間仍是影響顯色的因素。在一定時間內(nèi),，陰性孔可保持無色,，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強。適當提高溫度有助于加速顯色進行,。在定量測定中,，加入底物后的反應溫度和時間應按規(guī)定力求準確。定性測定的顯色可在室溫進行,，時間一般不需要嚴格控制,，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當縮短或延長反應時間，及時判斷,。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應20-30分鐘后即不再加深,，再延長反應時間,，可使本底值增高。OPD底物液受光照會自行變色,，顯色反應應避光進行,，顯色反應結束時加入終止液終止反應。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,，顯色由橙黃色轉向棕黃色,。
TMB受光照的影響不大，可在室溫中置于操作臺上,，邊反應邊觀察結果,。但為保證實驗結果的穩(wěn)定性，宜在規(guī)定的適當時間閱讀結果,。TMB經(jīng)HRP作用后,，約40分鐘顯色達頂，隨即逐漸減弱,，至2小時后即可全消退至無色,。TMB的終止液有多種，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應終止,。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪,，是目視判斷的良好終止劑。此外,，各類酸性終止液則會使藍色轉變成黃色,，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值。
(2) 比色
比色前應先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體,，然后將板正確放入酶標比色儀的比色架中,。以軟板為載體的試驗，需先將板置于標準96孔的座架中,，才可進行比色,。最好在加底物液顯色前，先將軟板邊緣剪凈,，這樣,，此板就可全平妥坐入座架中。
比色時應先以蒸餾水校零點,，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標本作全過程的孔）,，以記錄本次試驗的試劑狀況。其后可用空白孔以蒸餾水校零點,，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度,，然后進行計算。
比色結果的表達以往通用光密度（oplical density,，OD）,，現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence,，A），兩者含義相同,。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角,，如OPD的吸收波長為492nm,，表示方法為"A492nm"或"OD492nm"。
(3) 酶標比色儀
酶標比色儀簡稱酶標儀,，通常指專用于測讀 ELISA結果吸光度的光度計,。針對固相載體形式的不同，各有特制的適用于板,、珠和小試管的設計,。許多試劑公司配套供應酶標儀。酶標儀的主要性能指標有：測讀速度,、讀數(shù)的準確性,、重復性、精確度和可測范圍,、線性等等,。優(yōu)良的酶標儀的讀數(shù)一般可精確到0.001，準確性為±1%,，重復性達0.5%,。舉例說，若某孔測得的A值為1.083,，則該孔相對于空氣的真實A值應為1.083±0.01(1.073~1.093）,，重復測定數(shù)次，其A值均應在1.083±0.05（1.078~1.088）之間,。酶標儀的可測范圍視各酶標儀的性能而不同,。普通的酶標儀在0.000~2.000，新型號的酶標儀上限拓寬達2.900,，甚至更高,。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示。應注意可測范圍與線性范圍的不同,，線性范圍常小于可測范圍,，比如某一酶標儀的可測范圍為0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000,，這在定量ELISA中制作標準曲線時應予注意,。
酶標儀不應安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃,，使用前先預熱儀器15-30分鐘,，測讀結果更穩(wěn)定,。測讀 A值時，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,，如OPD用492nm波長,。有的酶標儀可用雙波長式測讀，即每孔先后測讀兩次,，第一次在最適波長（W1）,，第二次在不敏感波長（W2），兩次測定間不移動ELISA板的位置,。例如OPD用492nm為W1,，630nm為W2，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）,。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾,。
各種酶標儀性能有所不同，使用中應詳細閱讀說明書,。
7. 結果判斷
7.1. 定性測定:
定性測定的結果判斷是對受檢標本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答,，分別用"陽性"、"陰性"表示,。"陽性"表示該標本在該測定系統(tǒng)中有反應,。"陰性"則為無反應。用定性判斷法也可得到半定量結果,，即用滴度來表示反應的強度,，其實質(zhì)仍是一個定性試驗。在這種半定量測定中,，將標本作一系列稀釋后進行試驗,，呈陽性反應的最高稀釋度即為滴度。根據(jù)滴度的高低,，可以判斷標本反應性的強弱,，這比觀察不稀釋標本呈色的深淺判斷為強陽性、弱陽性更具定量意義,。
在間接法和夾心法 ELSIA中,，陽性孔呈色深于陰性孔。在競爭法ELISA中則相反,，陰性孔呈色深于陽性孔,。兩類反應的結果判斷方法不同，分述于下,。
(1) 間接法和夾心法
這類反應的定性結果可以用肉眼判斷,。目視標本也無色或近于無色者判為陰性，顯色清晰者為陽性,。但在 ELSIA中,，正常人血清反應后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異,，因此實驗中必須加測陰性對照,。陰性對照的組成應為不含受檢物的正常血清或類似物。在用肉眼判斷結果時,，更宜用顯色深于陰性對照作為標本陽性的指標,。目視法簡捷明了，但頗具主觀性,。在條件許可下，應該用比色計測定吸光值,，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù),。先讀出標本（sample，S）,、陽性對照（P）,、和陰性對照（N）的吸光值，然后進行計算,。計算方法有多種,，大致可分為陽性判定值法和標本與陰性對照比值法兩類。
a. 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù),，以此作為判斷結果陽性或陰性的標準,。
用此法判斷結果要求實驗條件十分恒定，試劑的制備必須標準化,，陽性和陰性的對照品應符合一定的規(guī)格,，須配用精密的儀器，并嚴格按規(guī)定操作,。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標本的實驗檢測而得到的?，F(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復鈣人血漿,，陽性對照品HBsAg的含量標明為P=9±2ng /ml,。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,，先計算陰性對照A值的平均數(shù)（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個特定的數(shù)值（例0.400），試驗才有效,。3個陰性對照A值均應≥0.5×NCX,，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍,，則棄去,，而已另兩個陰性對照重新計算NCX,；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍，則該次實驗無效,。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=NCX+0.05
標本 A值＞陽性判定值的為陽性,，小于陽性判定值的為陰性。應注意的是,，式中0.05為該試劑盒的常數(shù),，只適合于該特定條件下，而不是對各種試劑均可通用,。
根據(jù)以上敘述可以看出,，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用，試劑變質(zhì)和操作不當均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果,。
b. 標本/陰性對照比值
在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下,，這種判斷法較為合適。在得出標本（ S）和陰性對照（N）的A值后,，計算S/N值,。也有寫作P/N的，這里的P不代表陽性(positive),，而是病人（patient）的縮寫,，不應誤解。為避免混淆,，更宜用S/N表示,。在早期的間接法ELISA中，有些作者定出S/N為陽性標準,，現(xiàn)多為各種測定所沿用,。實際上每一測定系統(tǒng)應該用實驗求出各自的S/N的閾值。更應注意的是,，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清,。有的試劑盒中所設陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液，以致反應后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多,。因此,，這類試劑盒規(guī)，如N<0.05（或其他數(shù)值）,，則按0.05計算,，否則將出現(xiàn)假陽性結果。
(2) 競爭法
在競爭法 ELISA中,，陰性孔呈色深于陽性孔,。陰性呈色的強度取決于反應中酶結合物的濃度和加入競爭抑制物的量。
競爭法 ELISA不易用自視判斷結果，因肉眼很難辨別弱陽性反應與陰性對照的顯色差異,，一般均用比色計測定,，讀出S、P和N的吸光值,。計算方法主要也有兩種,，即陽性判定值法和抑制率法。
a. 陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同,，但在計算公式中引入陽性對照 A值,，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復鈣人血漿,，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml,。每次試驗設2個陽性對照和3個陰性對照。測得A值后,，先計算陰性對照A值的平均值（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗才有效。3個陰性對照A值均應小于2.000,，而且應≥0.5×NCX并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍,，則棄去,，而以另2個陰性對照重新計算×NCX；如有2個陰性對照A超出以上范圍,，則該次實驗無效,。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標本A值≤陽性判定值的反應為陽性，A＞陽性判定值的反應為陰性,。
b. 抑制率法
抑制率表示標本在競爭結合中標本對陰性反應顯色的抑制程度,，按下式計算：
抑制率（%）= （陰性對照A值-標本A值）×100%/陰性對照A值
一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性，＜50%為陰性,。
7.2. 定量測定:
ELSIA操作步驟復雜,，影響反應因素較多，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致,，因此在定量測定中,，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標準品在相同的條件下制作標準曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA,，標準曲線的范圍一般較寬,，曲線最高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙,，以檢測物的濃度為橫坐標,，以吸光度為縱坐標，將各濃度的值逐點連接，所得曲線一般呈S形,，其頭,、尾部曲線趨于平坦，中央較呈直線的部分是理想的檢測區(qū)域,。
測定小分子量物質(zhì)常用競爭法,，其標準曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關。標準曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同,。