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        酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA) 即將已知的抗原或抗體吸附在固相載體表面，使酶標(biāo)記的抗原抗體反應(yīng)在固相表面進行的技術(shù)。該技術(shù)可用于檢測大分子抗原和特異性抗體等，具有快速,、靈敏、簡便,、載體易于標(biāo)準(zhǔn)化等優(yōu)點,。免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理，對待測抗體或者抗原進行分析測定的方法,，酶聯(lián)免疫吸附分析是免疫分析的一種,，分三個部分組成：免疫識別，信號輸出和數(shù)據(jù)處理,。保證ELISA檢測結(jié)果準(zhǔn)確可靠的必要條件有優(yōu)質(zhì)的試劑,，良好的儀器和正確的操作。嚴(yán)格遵照使用說明規(guī)定操作,，必能得出準(zhǔn)確的結(jié)果,。

1.  標(biāo)本的采取和保存
可用作 ELISA測定的標(biāo)本十分廣泛，體液（如血清）,、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液,、糞便）等均可作標(biāo)本以測定其中某種抗體或抗原成份。有些標(biāo)本可直接進行測定（如血清,、尿液）,，有些則需經(jīng)預(yù)處理（如糞便和某些分泌物）。大部分ELISA檢測以血清標(biāo)本為主,。血漿中除尚含有纖維蛋白原和抗凝劑外,，其他成份均同等于血清。制備血漿標(biāo)本需借助于抗凝劑,，而血清標(biāo)本只要待血清自然凝固,、xue塊收縮后即可取得。血清標(biāo)本可按常規(guī)方法采集，應(yīng)注意避免溶血,，紅細胞溶解時會釋放出具有過氧化物酶活性的物質(zhì)，以HRP為標(biāo)記的ELISA測定中,，溶血標(biāo)本可能會增加非特異性顯色,。
血清標(biāo)本宜在新鮮時檢測。如有細菌污染,，菌體中可能含有內(nèi)源性HRP,，也會產(chǎn)生假陽性反應(yīng)。一般說來,，在3天內(nèi)測定的血清標(biāo)本可放置于4℃,，超過一周測定的需低溫冰存。凍結(jié)血清融解后,，蛋白質(zhì)局部濃縮,，分布不均，應(yīng)充分混勻宜輕緩,，避免氣泡,，可上下顛倒混和，不要在混勻器上強烈振蕩,?；鞚峄蛴谐恋淼难鍢?biāo)本應(yīng)先離心或過濾，澄清后再檢測,。反復(fù)凍融會使抗體效價跌落,，所以測抗體的血清標(biāo)本如需保存作多次檢測，宜少量分裝冰存,。保存血清自采集時就應(yīng)注意無菌操作,，也可加入適當(dāng)防腐劑。

2.   試劑的準(zhǔn)備
按試劑盒說明書的要求準(zhǔn)備實驗中需用的試劑,。 ELISA中用的蒸餾水或去離子水,，包括用于洗滌的，應(yīng)為新鮮的和高質(zhì)量的,。自配的緩沖液應(yīng)用pH計測量較正,。從冰箱中取出的試驗用試劑應(yīng)待溫度與室溫平衡后使用。試劑盒中本次試驗不需用的部分應(yīng)及時放回冰箱保存,。

3.  加樣
在 ELISA中一般有3次加樣步聚,，即加標(biāo)本，加酶結(jié)合物,，加底物,。加樣時應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部,，并注意不可濺出,，不可產(chǎn)生氣泡,。加標(biāo)本一般用微量加樣器，按規(guī)定的量加入板孔中,。每次加標(biāo)本應(yīng)更換吸嘴,，以免發(fā)生交叉污染，也可用一次性的定量塑料管加樣,。如測定需用稀釋的血清（如間接法 ELISA）,，可在試管中按規(guī)定的稀釋度稀釋后再加樣。也可在板孔中加入稀釋液,，再在其中加入血清標(biāo)本,，然后在微型震蕩器上震蕩1分鐘以保證混和。加酶結(jié)合物應(yīng)用液和底物應(yīng)用液時可用定量多道加液器,，使加液過程迅速完成,。

4.  保溫
在 ELISA中一般有兩次抗原抗體反應(yīng)，即加標(biāo)本和加酶結(jié)合物后,?？乖贵w反應(yīng)的完成需要有一定的溫度和時間，這一保溫過程稱為溫育(incubation)或孵育,。
ELISA屬固相免疫測定,，抗原、抗體的結(jié)合只在固相表面上發(fā)生,。以抗體包被的夾心法為例,，加入板孔中的標(biāo)本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗結(jié)合的機會,，只有最貼近孔壁的一層溶液中的抗原直接與抗體接觸,。這是一個逐步平衡的過程，因此需經(jīng)擴散才能達到反應(yīng)的終點,。在其后加入的酶標(biāo)記抗體與固相抗原的結(jié)合也同樣如此,。這就是為什么ELISA反應(yīng)總是需要一定時間的溫育。
溫育常采用的溫度有 43℃,、37℃,、室溫和4℃（冰箱溫度）等。37℃是實驗室中常用的保溫溫度,，也是大多數(shù)抗原抗體結(jié)合的合適溫度,。在建立ELISA方法作反應(yīng)動力學(xué)研究時，實驗表明,，兩次抗原抗體反應(yīng)一般在37℃經(jīng)1-2小時,，產(chǎn)物的生成可達頂。為加速反應(yīng)，可提高反應(yīng)的溫度,，有些試驗在43℃進行,，但不宜采用更高的溫度?？乖贵w反應(yīng)4℃更為徹di,，在放射免疫測定中多使反應(yīng)在冰箱中過夜,，以形成最多的沉淀,。但因所需時間太長,，在ELISA中一般不予采用,。

5.  洗滌
洗滌在 ELISA過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,，但卻也決定著實驗的成敗。ELISA就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標(biāo)記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。聚苯y(tǒng)i烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的,，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,。可以說在ELISA操作中,，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù),，應(yīng)引起操作者的高度重視，操作者應(yīng)嚴(yán)格按要求洗滌,，不得馬虎,。
洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種,，過程如下：
(1) 浸泡式： a.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液,；b.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）,；c.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔，放置1-2分鐘,，間歇搖動,，浸泡時間不可隨意縮短；d.吸干孔內(nèi)液體,。吸干應(yīng)徹di,，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干,；e.重復(fù)操作c和d,，洗滌3-4次（或按說明規(guī)定）。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯y(tǒng)i烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團,，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用,，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體。洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫 20,，其濃度可在0.05%-0.2%之間,，高于0.2%時，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度,。
(2) 流水沖洗式：流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水。洗滌時附接一特殊裝置,，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗,，持續(xù)沖洗 2分鐘后，吸干液體,，再用蒸餾水浸泡2分鐘,，吸干即可。浸泡式猶如盆浴,，流水沖洗式則好比淋浴,，其洗滌效果更為徹di，且也簡便,、快速,。已有實驗表明，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌,。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓,，讓水流沖擊板孔表面，洗滌效果更佳,。

6.   顯色和比色
(1) 顯色
顯色是 ELISA中的最后一步溫育反應(yīng),，此時酶催化無色的底物生成有色的產(chǎn)物。反應(yīng)的溫度和時間仍是影響顯色的因素,。在一定時間內(nèi),，陰性孔可保持無色，而陽性孔則隨時間的延長而呈色加強,。適當(dāng)提高溫度有助于加速顯色進行,。在定量測定中,，加入底物后的反應(yīng)溫度和時間應(yīng)按規(guī)定力求準(zhǔn)確。定性測定的顯色可在室溫進行,，時間一般不需要嚴(yán)格控制,，有時可根據(jù)陽性對照孔和陰性對照孔的顯色情況適當(dāng)縮短或延長反應(yīng)時間，及時判斷,。
OPD底物顯色一般在室外溫或37℃反應(yīng)20-30分鐘后即不再加深,，再延長反應(yīng)時間，可使本底值增高,。OPD底物液受光照會自行變色,，顯色反應(yīng)應(yīng)避光進行，顯色反應(yīng)結(jié)束時加入終止液終止反應(yīng),。OPD產(chǎn)物用硫酸終止后,，顯色由橙黃色轉(zhuǎn)向棕黃色。
TMB受光照的影響不大,，可在室溫中置于操作臺上，邊反應(yīng)邊觀察結(jié)果,。但為保證實驗結(jié)果的穩(wěn)定性,，宜在規(guī)定的適當(dāng)時間閱讀結(jié)果。TMB經(jīng)HRP作用后,，約40分鐘顯色達頂,，隨即逐漸減弱，至2小時后即可全消退至無色,。TMB的終止液有多種,，疊氮鈉和十二烷基硫酸鈉（SDS）等酶抑制劑均可使反應(yīng)終止。這類終止劑尚能使藍色維持較長時間（12-24小時）不褪,，是目視判斷的良好終止劑,。此外，各類酸性終止液則會使藍色轉(zhuǎn)變成黃色,，此時可用特定的波長（450nm）測讀吸光值,。
(2) 比色
比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中,。以軟板為載體的試驗,，需先將板置于標(biāo)準(zhǔn)96孔的座架中，才可進行比色,。最好在加底物液顯色前,，先將軟板邊緣剪凈，這樣,，此板就可全平妥坐入座架中,。
比色時應(yīng)先以蒸餾水校零點,，測讀底物孔（未經(jīng)任何反應(yīng)僅加底物液的孔）和空白孔（以生理鹽水或稀釋液代替標(biāo)本作全過程的孔），以記錄本次試驗的試劑狀況,。其后可用空白孔以蒸餾水校零點,，以上各孔的吸光度需減去空白孔的吸光度，然后進行計算,。
比色結(jié)果的表達以往通用光密度（oplical density,，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence,，A）,，兩者含義相同。通常的表示方法是,，將吸收波長寫于A字母的右下角,，如OPD的吸收波長為492nm，表示方法為"A492nm"或"OD492nm",。
(3) 酶標(biāo)比色儀
酶標(biāo)比色儀簡稱酶標(biāo)儀,，通常指專用于測讀 ELISA結(jié)果吸光度的光度計。針對固相載體形式的不同,，各有特制的適用于板,、珠和小試管的設(shè)計。許多試劑公司配套供應(yīng)酶標(biāo)儀,。酶標(biāo)儀的主要性能指標(biāo)有：測讀速度,、讀數(shù)的準(zhǔn)確性、重復(fù)性,、精確度和可測范圍,、線性等等。優(yōu)良的酶標(biāo)儀的讀數(shù)一般可精確到0.001,，準(zhǔn)確性為±1%,，重復(fù)性達0.5%。舉例說,，若某孔測得的A值為1.083,，則該孔相對于空氣的真實A值應(yīng)為1.083±0.01(1.073~1.093），重復(fù)測定數(shù)次,，其A值均應(yīng)在1.083±0.05（1.078~1.088）之間,。酶標(biāo)儀的可測范圍視各酶標(biāo)儀的性能而不同。普通的酶標(biāo)儀在0.000~2.000,，新型號的酶標(biāo)儀上限拓寬達2.900,，甚至更高。超出可測上限的A值常以"*"或"over"或其它符號表示,。應(yīng)注意可測范圍與線性范圍的不同,，線性范圍常小于可測范圍,，比如某一酶標(biāo)儀的可測范圍為0.000~2.900，而其線性范圍僅0.000~2.000,，這在定量ELISA中制作標(biāo)準(zhǔn)曲線時應(yīng)予注意,。
酶標(biāo)儀不應(yīng)安置在陽光或強光照射下，操作時室溫宜在15~30℃,，使用前先預(yù)熱儀器15-30分鐘,，測讀結(jié)果更穩(wěn)定。測讀 A值時,，要選用產(chǎn)物的敏感吸收峰,，如OPD用492nm波長。有的酶標(biāo)儀可用雙波長式測讀,，即每孔先后測讀兩次,，第一次在最適波長（W1），第二次在不敏感波長（W2）,，兩次測定間不移動ELISA板的位置,。例如OPD用492nm為W1，630nm為W2,，最終測得的A值為兩者之差（W1-W2）,。雙波長式測讀可減少由容器上的劃痕或指印等造成的光干擾。
各種酶標(biāo)儀性能有所不同,，使用中應(yīng)詳細閱讀說明書,。

7.  結(jié)果判斷
7.1.  定性測定:
定性測定的結(jié)果判斷是對受檢標(biāo)本中是否含有待測抗原或抗體作出 "有"或"無"的簡單回答,，分別用"陽性",、"陰性"表示。"陽性"表示該標(biāo)本在該測定系統(tǒng)中有反應(yīng),。"陰性"則為無反應(yīng),。用定性判斷法也可得到半定量結(jié)果，即用滴度來表示反應(yīng)的強度,，其實質(zhì)仍是一個定性試驗,。在這種半定量測定中，將標(biāo)本作一系列稀釋后進行試驗,，呈陽性反應(yīng)的最高稀釋度即為滴度,。根據(jù)滴度的高低，可以判斷標(biāo)本反應(yīng)性的強弱,，這比觀察不稀釋標(biāo)本呈色的深淺判斷為強陽性,、弱陽性更具定量意義。
在間接法和夾心法 ELSIA中,，陽性孔呈色深于陰性孔,。在競爭法ELISA中則相反,，陰性孔呈色深于陽性孔。兩類反應(yīng)的結(jié)果判斷方法不同,，分述于下,。
(1)   間接法和夾心法
這類反應(yīng)的定性結(jié)果可以用肉眼判斷。目視標(biāo)本也無色或近于無色者判為陰性,，顯色清晰者為陽性,。但在 ELSIA中，正常人血清反應(yīng)后?？沙霈F(xiàn)呈色的本底,，此本底的深淺因試劑的組成和實驗的條件不同而異，因此實驗中必須加測陰性對照,。陰性對照的組成應(yīng)為不含受檢物的正常血清或類似物,。在用肉眼判斷結(jié)果時，更宜用顯色深于陰性對照作為標(biāo)本陽性的指標(biāo),。目視法簡捷明了,，但頗具主觀性。在條件許可下,，應(yīng)該用比色計測定吸光值,，這樣可以得到客觀的數(shù)據(jù)。先讀出標(biāo)本（sample,，S）,、陽性對照（P）、和陰性對照（N）的吸光值,，然后進行計算,。計算方法有多種，大致可分為陽性判定值法和標(biāo)本與陰性對照比值法兩類,。
a. 陽性判定值
陽性判定值（cut-off value）一般為陰性對照A值加上一個特定的常數(shù),，以此作為判斷結(jié)果陽性或陰性的標(biāo)準(zhǔn)。
用此法判斷結(jié)果要求實驗條件十分恒定,，試劑的制備必須標(biāo)準(zhǔn)化,，陽性和陰性的對照品應(yīng)符合一定的規(guī)格，須配用精密的儀器,，并嚴(yán)格按規(guī)定操作,。陽性判定值公式中的常數(shù)是在這特定的系統(tǒng)中通過對大量標(biāo)本的實驗檢測而得到的。現(xiàn)舉某種檢測 HBsAg的試劑盒為例,。試劑盒中的陰性對照品為不含HBsAg的復(fù)鈣人血漿,，陽性對照品HBsAg的含量標(biāo)明為P=9±2ng /ml。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照,。測得A值后,，先計算陰性對照A值的平均數(shù)（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個平均數(shù)的差（P-N）必須大于一個特定的數(shù)值（例0.400），試驗才有效,。3個陰性對照A值均應(yīng)≥0.5×NCX,，并≤1.5×NCX，如其中之一超出此范圍,，則棄去,，而已另兩個陰性對照重新計算NCX；如有兩個陰性對照A值超出以上范圍,，則該次實驗無效,。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=NCX+0.05
標(biāo)本 A值＞陽性判定值的為陽性，小于陽性判定值的為陰性,。應(yīng)注意的是,，式中0.05為該試劑盒的常數(shù)，只適合于該特定條件下,，而不是對各種試劑均可通用,。
根據(jù)以上敘述可以看出，在這種方法中陰性對照和陽性對照也起到試驗的質(zhì)控作用,，試劑變質(zhì)和操作不當(dāng)均會產(chǎn)生"試驗無效"的后果,。
b. 標(biāo)本/陰性對照比值
在實驗條件（包括試劑）較難保證恒定的情況下，這種判斷法較為合適,。在得出標(biāo)本（ S）和陰性對照（N）的A值后,，計算S/N值。也有寫作P/N的,，這里的P不代表陽性(positive),，而是病人（patient）的縮寫，不應(yīng)誤解,。為避免混淆,，更宜用S/N表示,。在早期的間接法ELISA中,，有些作者定出S/N為陽性標(biāo)準(zhǔn)，現(xiàn)多為各種測定所沿用,。實際上每一測定系統(tǒng)應(yīng)該用實驗求出各自的S/N的閾值,。更應(yīng)注意的是，N所代表的陰性對照是不含受檢物質(zhì)的人血清,。有的試劑盒中所設(shè)陰性對照為不含蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)含量較底的緩沖液,，以致反應(yīng)后產(chǎn)生的本底可能較正常人血清的本底低得多。因此,，這類試劑盒規(guī),，如N<0.05（或其他數(shù)值）,，則按0.05計算，否則將出現(xiàn)假陽性結(jié)果,。
(2) 競爭法
在競爭法 ELISA中,，陰性孔呈色深于陽性孔。陰性呈色的強度取決于反應(yīng)中酶結(jié)合物的濃度和加入競爭抑制物的量,。
競爭法 ELISA不易用自視判斷結(jié)果,，因肉眼很難辨別弱陽性反應(yīng)與陰性對照的顯色差異，一般均用比色計測定,，讀出S,、P和N的吸光值。計算方法主要也有兩種,，即陽性判定值法和抑制率法,。
a. 陽性判定值法
與間接法和夾心法中的陽性判定值法基本相同，但在計算公式中引入陽性對照 A值,，現(xiàn)舉某種檢測抗HBc的試劑盒為例,。試劑盒中的陰性對照為不含抗HBc的復(fù)鈣人血漿，陽性對照中抗HBc含量為125±1 00u/ml,。每次試驗設(shè)2個陽性對照和3個陰性對照,。測得A值后，先計算陰性對照A值的平均值（NC X ）和陽性對照A值的平均數(shù)（PCX）,，兩個平均數(shù)的差（N-P）必須大于一個特定的數(shù)值（例如0.300）,試驗才有效,。3個陰性對照A值均應(yīng)小于2.000，而且應(yīng)≥0.5×NCX并≤1.5×NCX,，如其中之一超出此范圍,，則棄去，而以另2個陰性對照重新計算×NCX,；如有2個陰性對照A超出以上范圍,，則該次實驗無效。陽性判定值按下式計算：
陽性判定值=0.4×NCX+0.6×PCX
標(biāo)本A值≤陽性判定值的反應(yīng)為陽性,，A＞陽性判定值的反應(yīng)為陰性,。
b. 抑制率法
抑制率表示標(biāo)本在競爭結(jié)合中標(biāo)本對陰性反應(yīng)顯色的抑制程度，按下式計算：
抑制率（%）= （陰性對照A值-標(biāo)本A值）×100%/陰性對照A值
一般規(guī)定抑制率≥50%為陽性,，＜50%為陰性,。
7.2. 定量測定:
ELSIA操作步驟復(fù)雜，影響反應(yīng)因素較多,，特別是固相載體的包被難達到各個體之間的一致,，因此在定量測定中，每批測試均須用一系列不同濃度的參考標(biāo)準(zhǔn)品在相同的條件下制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。測定大分子量物質(zhì)的夾心法ELISA,，標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍一般較寬,，曲線最高點的吸光度可接近2.0，繪制時常用半對數(shù)紙,，以檢測物的濃度為橫坐標(biāo),，以吸光度為縱坐標(biāo)，將各濃度的值逐點連接,，所得曲線一般呈S形,，其頭、尾部曲線趨于平坦,，中央較呈直線的部分是理想的檢測區(qū)域,。
測定小分子量物質(zhì)常用競爭法，其標(biāo)準(zhǔn)曲線中吸光度與受檢物質(zhì)的濃度呈負相關(guān),。標(biāo)準(zhǔn)曲線的形狀因試劑盒所用模式的差別而略有不同,。