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蛋白質(zhì)印跡（WB）實(shí)驗(yàn)操作步驟
閱讀：512 發(fā)布時(shí)間：2025-1-7WB,，蛋白質(zhì)印跡(Western blotting)又稱免疫印跡(immunoblotting)，是根據(jù)抗原抗體的特異性結(jié)合檢測復(fù)雜樣品中的某種蛋白的方法,。該法是在凝膠電泳和固相免疫測定技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新的免疫生化技術(shù),，具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫測定的高特異性和敏感性，現(xiàn)已成為蛋白分析的一種常規(guī)技術(shù),。免疫印跡常用于鑒定某種蛋白,，并能對蛋白進(jìn)行定性和半定量分析。
WB實(shí)驗(yàn)操作步驟：
1,、收集蛋白樣品
蛋白提取的質(zhì)量直接決定著 WB 結(jié)果的好壞,，因此，根據(jù)標(biāo)本類型和檢測類型選擇合適的蛋白制備方法是至關(guān)重要的,。
使用Western及IP細(xì)胞裂解液裂解貼壁細(xì)胞,、懸浮細(xì)胞或組織樣品，為了防止蛋白的降解,，或保證磷酸化或乙?；鞍椎姆€(wěn)定，需要額外添加蛋白酶抑制劑 / 蛋白酶抑制劑,、磷酸酶抑制劑等蛋白抑制劑,、或者乙酰化酶抑制劑混合物,。
對于某些特定的亞細(xì)胞組份蛋白,，例如細(xì)胞核蛋白的細(xì)胞核蛋白提取試劑盒 、細(xì)胞漿蛋白細(xì)胞膜蛋白與細(xì)胞漿蛋白提取試劑盒,、線粒體蛋白等,，可以參考相關(guān)文獻(xiàn)提取這些亞細(xì)胞組分蛋白，也可使用商業(yè)化的試劑盒進(jìn)行提取,。
收集完蛋白樣品后，為確保每個(gè)蛋白樣品的上樣量一致,，需要測定每個(gè)蛋白樣品的蛋白濃度,。根據(jù)所使用的裂解液的不同,，需要采用適當(dāng)?shù)牡鞍诐舛葴y定方法。目前常用BAC試劑盒測定樣品蛋白的含量,。
2,、電泳
（1）蛋白樣品的變性
取相同質(zhì)量的細(xì)胞裂解液（體積×蛋白質(zhì)濃度），并加等體積的sds-page蛋白上樣緩沖液,，若樣品是非變性的,，可加入非變性的上樣緩沖液。電泳樣品加入樣品處理液后,，要經(jīng)過高溫處理,，其目的是將SDS與蛋白質(zhì)充分結(jié)合，以使蛋白質(zhì)*變性和解聚,，并形成棒狀結(jié)構(gòu),。樣品處理液中通常還加入溴酚藍(lán)染料，溴酚藍(lán)指示劑是一個(gè)較小的分子,，可以自由通過凝膠孔徑,，所以它顯示著電泳的前沿位置，當(dāng)指示劑到達(dá)凝膠底部時(shí),，即可停止電泳,。另外樣品處理液中也可加入適量的蔗糖或甘油以增大溶液密度，使加樣時(shí)樣品溶液可以沉入樣品凹槽底部,。至此,，電泳樣品已準(zhǔn)備就緒，可立即使用也可以分裝凍存,，-20℃存放的樣品可穩(wěn)定保持?jǐn)?shù)月,。
（2）電泳凝膠制備
電泳凝膠的制備可以直接使用sds-page試劑盒進(jìn)行操作。
（3）上樣和電泳
冰上冷卻后,，把將處理好的蛋白樣品按照預(yù)定的順序上樣到SDS-PAGE膠加樣孔內(nèi)中,。注意的是加樣孔有多時(shí)，可加入等體積的上樣緩沖液,，最后記得點(diǎn)上預(yù)染蛋白質(zhì)分子量Marker,。預(yù)染Marker便于在電泳過程中監(jiān)測蛋白質(zhì)分離，也可以在隨后的轉(zhuǎn)膜步驟中指示轉(zhuǎn)移效率,。Marker也用樣品緩沖液調(diào)整至與樣品等體積,。
加足夠的電泳緩沖液后開始準(zhǔn)備上樣。（電泳液至少要漫過內(nèi)測的小玻璃板,。）用微量進(jìn)樣器貼壁吸取樣品,，將樣品吸出不要吸進(jìn)氣泡。將加樣器針頭插至加樣孔中緩慢加入樣品,。（加樣太快可使樣品沖出加樣孔,，若有氣泡也可能使樣品溢出,。加入下一個(gè)樣品時(shí)，進(jìn)樣器需在外槽電泳緩沖液中洗滌3次,，以免交叉污染,。
3、轉(zhuǎn)膜
（1）,、*常用于Western Blot的轉(zhuǎn)移膜主要是聚偏二氟乙烯（Polyvinylidene Fluoride, PVDF膜,。
（2）、在加電泳轉(zhuǎn)移緩沖液的搪瓷盤里放入轉(zhuǎn)膜用的夾子,、兩塊海綿墊,、一支玻棒、濾紙和浸過的膜,。
（3）,、將夾子打開使黑的一面保持水平。在上面墊一張海綿墊,，用玻棒來回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡,。（一手搟另一手要壓住墊子使其不能隨便移動。）在墊子上墊三層濾紙（可三張紙先疊在一起在墊于墊子上）,，一手固定濾紙一手用玻棒搟去其中的氣泡,。
（4）、要先將玻璃板撬掉才可剝膠,，撬的時(shí)候動作要輕,，要在兩個(gè)邊上輕輕的反復(fù)撬。撬一會兒玻璃板便開始松動,，直到撬去玻板,。（撬時(shí)一定要小心，玻板很易裂,。）除去小玻璃板后,，將濃縮膠輕輕刮去（濃縮膠影響操作），要避免把分離膠刮破,。小心剝下分離膠蓋于濾紙上,，用手調(diào)整使其與濾紙對齊，輕輕除去氣泡,。將膜蓋于膠上,，要蓋滿整個(gè)膠（膜蓋下后不可再移動）并除氣泡。在膜上蓋3張濾紙并除去氣泡,。最后蓋上另一個(gè)海綿墊,，搟幾下就可合起夾子。整個(gè)操作在轉(zhuǎn)移液中進(jìn)行,，要不斷的搟去氣泡,。膜兩邊的濾紙不能相互接觸,，接觸后會發(fā)生短路。（轉(zhuǎn)移液含甲醇,，操作時(shí)要戴手套，實(shí)驗(yàn)室要開門以使空氣流通,。）
4,、封閉
雜交膜上有很多非特異性的蛋白質(zhì)結(jié)合位點(diǎn)，為防止這些位點(diǎn)與抗體結(jié)合引起非特異的染色和背景,，一般用惰性蛋白質(zhì)或非離子去污劑封閉膜上的未結(jié)合位點(diǎn)來降低抗體的非特異性結(jié)合,。封閉劑應(yīng)該封閉所有未結(jié)合位點(diǎn)而不替換膜上的靶蛋白、不結(jié)合靶蛋白的表位,，也不與抗體或檢測試劑有交叉反應(yīng),。常用的封閉試劑有 5%的BSA或者脫脂奶粉，緩沖液一般選擇 PBST或者TBST,，或者封閉液,。
一般封閉條件為：室溫或者 37℃緩慢搖蕩1～2h，特殊情況也可 4℃過夜,。根據(jù)結(jié)果情況調(diào)整封閉試劑的濃度和類型,。比如有時(shí) BSA 比脫脂奶粉更有利于降低非特異性背景，而有些抗體則在脫脂奶粉封閉的情況下才能得到清晰的背景,。
封閉完成后要進(jìn)行洗膜,，以去除膜上未結(jié)合的封閉試劑。
5,、一抗和二抗孵育
一抗孵育
按照適當(dāng)比例用TBST或者一抗稀釋液稀釋一抗,。
吸盡封閉液后，立即加入稀釋好的一抗,，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動孵育1～2小時(shí),。如果一抗孵育一小時(shí)效果不佳，可以在4℃緩慢搖動孵育過夜,。
回收一抗,。然后加入Western洗滌液或者TBST，在搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘,。吸盡洗滌液后,，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘,。共洗滌6次,。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
二抗孵育
按照適當(dāng)比例用TBST或者二抗稀釋液稀釋二抗
吸盡洗滌液后,，立即加入稀釋好的二抗,，室溫或4℃在搖床上緩慢搖動孵育1～2小時(shí),。
然后加入Western洗滌液或者TBST，在搖床上緩慢搖動洗滌5-10分鐘,。吸盡洗滌液后,，再加入洗滌液，洗滌5-10分鐘,。共洗滌3次,。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
前2步洗滌是為了洗去一抗和二抗的非特異性結(jié)合,，洗滌的效果直接影響結(jié)果背景的深淺,，所以洗滌一定要干凈。洗滌液使用 TBST 或者 PBST,，其中的 Tween20 有助于去除非特異性的結(jié)合,，減少背景。同時(shí)短時(shí)間多次的洗膜（如 5-6次,，每次 3分鐘）比 長時(shí)間少次數(shù)的洗膜更有效,。
Western結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照，通?？梢赃x用Tubulin抗體,、Actin抗體或GAPDH抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測,。
6,、顯色反應(yīng)
底物發(fā)光法：將兩種顯色底物1：1等體積混合后將其覆蓋在膜表面使其均勻，用玻璃膠片把膜包起來,，馬上在暗室中將X光片覆蓋在膜的上面（時(shí)間根據(jù)光的亮度來衡量）,，顯影、定影,。（熒光在一段時(shí)間后會越來越弱,，要控制好時(shí)間）
7、蛋白膜的重復(fù)利用
如果蛋白樣品非常寶貴,，可以使用Western一抗二抗去除液或者TBST處理蛋白膜,，以重復(fù)利用蛋白膜。