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抗體特異性及交叉反應(yīng)分析
閱讀：269 發(fā)布時(shí)間：2024-12-24抗體（antibody，Ab）是機(jī)體在體內(nèi)存在的外來分子,、微生物等抗原物質(zhì)刺激下,，由B淋巴細(xì)胞或記憶細(xì)胞增殖分化成的漿細(xì)胞所產(chǎn)生的、可與相應(yīng)抗原發(fā)生特異性結(jié)合的免疫球蛋白（immunoglobulins,，Ig）,，主要分布在血清中，也分布于組織液及外分泌液中,?？贵w特異性鑒定是免疫化學(xué)技術(shù)中，確?？乖?抗體反應(yīng)專一性的基礎(chǔ),。從根本上驗(yàn)證特異性，投稿國際期刊,，常常需要準(zhǔn)備這方面數(shù)據(jù),。
鑒定抗體的特異性有四種基本方法：分子遺傳法、獨(dú)立抗體驗(yàn)證法、正交法和標(biāo)簽蛋白法,。四種方法并非必須同時(shí)采用,。通常，根據(jù)實(shí)驗(yàn)的目的和研究設(shè)計(jì)的特點(diǎn),，選擇對自己的實(shí)驗(yàn)來說具有說服力的1到2種即可,。
1、分子遺傳法,。
對于遺傳編碼清楚的蛋白質(zhì),，可采用分子遺傳學(xué)技術(shù)（基因敲除模型、CRISPR-Cas9,、RNA干擾等）將該蛋白的表達(dá)水平顯著降低,，然后用待檢抗體進(jìn)行標(biāo)記。如果得到陽性減弱或消失的結(jié)果,，說明抗體標(biāo)記的正是該蛋白質(zhì),。采用該方法要注意兩個(gè)問題。其一,，針對基因的敲除或敲減操作不一定能馬上減少相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平,。有的蛋白質(zhì)在生物樣本中可能有足量儲(chǔ)備，存在“緩沖池",；必須耗去這部分存量才能觀察到表達(dá)的下降,。能否在允許的時(shí)間內(nèi)下調(diào)蛋白水平，是一個(gè)需要預(yù)試的問題,。其二,，基因及相應(yīng)的蛋白質(zhì)水平下調(diào)后，抗體標(biāo)記強(qiáng)度減弱,，其實(shí)驗(yàn)證了抗體和該基因產(chǎn)物的“相關(guān)性",，但嚴(yán)格說來，還有可能標(biāo)記的并不是目標(biāo)蛋白質(zhì),。尚存在這樣的可能：抗體標(biāo)記的蛋白質(zhì)是與目標(biāo)蛋白有密切相互作用的另一種蛋白,。比如，目標(biāo)蛋白減少后,，抗體實(shí)際標(biāo)記的蛋白無從錨定（比如膜蛋白）,，進(jìn)而在標(biāo)本處理過程中流失，結(jié)果免疫標(biāo)記強(qiáng)度減弱,。此時(shí)應(yīng)設(shè)計(jì)針對性的實(shí)驗(yàn)來補(bǔ)充驗(yàn)證,。
2、獨(dú)立抗體驗(yàn)證法,。
同一目標(biāo)分子,，可采用針對不同抗原決定簇的抗體來標(biāo)記,。當(dāng)需要對某種蛋白分子進(jìn)行免疫標(biāo)記時(shí)，如果手中已有經(jīng)過特異性鑒定合格的其他抗體,，且識(shí)別的結(jié)構(gòu)位點(diǎn)與待檢抗體不同,，那么原有抗體就可作為一個(gè)良好的陽性參照。如果待檢抗體與原有的合格抗體具有相同的標(biāo)記結(jié)果,，說明待檢抗體的特異性是合格的,。本法應(yīng)用時(shí)須注意蛋白分子亞型之間的區(qū)別。比如,，待檢抗體與原有合格抗體的識(shí)別位點(diǎn)在有的亞型二者都存在,，而有的亞型則可能缺少其中之一。結(jié)構(gòu)變化可能引起功能和分布的差別,，此時(shí)本法就不能起到鑒定作用,。
3、正交法,。
正交法即采用互不影響的技術(shù)對抗體標(biāo)記的是否為目標(biāo)分子進(jìn)行鑒定的方法,。比如要鑒定抗體是否能特異性標(biāo)記某蛋白質(zhì)，可通過質(zhì)譜技術(shù),、色譜分離技術(shù),、針對生成該蛋白的RNA的原位雜交等，與抗體標(biāo)記一道進(jìn)行平行實(shí)驗(yàn),。如果不同技術(shù)的檢測豐度/強(qiáng)度一致,，說明抗體的標(biāo)記具有特異性。采用該法時(shí)須注意各種技術(shù)自身的非特異性問題,，避免因參照技術(shù)本身的特異性缺陷而減弱鑒定結(jié)果的說服力,。
4、標(biāo)簽蛋白法,。
可采用FLAG,、V5等親和標(biāo)簽或GFP等熒光偶聯(lián)蛋白對待檢抗體進(jìn)行鑒定。如果抗親和標(biāo)簽的抗體標(biāo)記強(qiáng)度或熒光信號強(qiáng)度與待檢抗體的標(biāo)記強(qiáng)度一致,，則說明待檢抗體具有特異性。
特異性的選擇主要需要考慮四個(gè)方面：蛋白特異性,、種屬特異性,、實(shí)驗(yàn)方法特異性、標(biāo)記物的特異性,。
1,、蛋白特異性
針對需要檢測的蛋白查找抗體，幾個(gè)細(xì)節(jié)要區(qū)分：
a.重組蛋白如果不是全長表達(dá),，則需要注意抗體的免疫原區(qū)域是否在重組蛋白區(qū)域內(nèi),。
b.內(nèi)源性蛋白最好能清楚其剪切與修飾的方式，特殊表型的蛋白需要進(jìn)行序列比對，并結(jié)合抗體免疫原序列,，查看交叉反應(yīng)的情況,。
c.磷酸化蛋白檢測需要確定具體位點(diǎn)，不同位點(diǎn)的磷酸化意味著可能有不同的機(jī)制存在,，不宜一概而論,。
2、種屬特異性
同種蛋白不同物種,，有著或大或小的差異,。
a.目前大部分商品化抗體都是以人源蛋白序列為模板重組蛋白或設(shè)計(jì)多肽抗原的，根據(jù)蛋白的同源性的情況與其他種屬發(fā)生交叉反應(yīng),。需要參照說明書注明的可反應(yīng)種屬信息,。
b.一些稀有種屬很難找到抗體，可以通過蛋白的序列比對,，選擇同源序列免疫的抗體,，不過一般這種情況生產(chǎn)商不會(huì)受理其關(guān)于質(zhì)量的申訴，如果可以申請到免費(fèi)的抗體樣品,，則利于抗體選擇,。
3、實(shí)驗(yàn)方法特異性
目前使用抗體的實(shí)驗(yàn)方法有很多,，不同的使用方法過程中,，因?yàn)閷Φ鞍讟悠返奶幚矸绞讲灰粯樱鞍椎暮坑胁町?，對抗體的識(shí)別表位和效價(jià)要求都是不一樣的,。
4、標(biāo)記物的特異性
一般基于實(shí)驗(yàn)操作的實(shí)驗(yàn)方法不會(huì)使用帶有標(biāo)記的一抗,，比如 WB,、IHC 等，都是通過二抗類的試劑標(biāo)記達(dá)到結(jié)果呈現(xiàn)的目的,。但是基于儀器分析的一些實(shí)驗(yàn),，可能就會(huì)使用到直接標(biāo)記的一抗，比如流式實(shí)驗(yàn),。那么需要了解到自己將要使用的儀器能檢測到的熒光范圍,，針對不通的參數(shù)要求選擇對應(yīng)的標(biāo)記物。在免疫熒光雙標(biāo)實(shí)驗(yàn)中,，需要選配不同的熒光標(biāo)記物,。
抗體能特異性地識(shí)別相應(yīng)的抗原，并與之結(jié)合,。這種結(jié)合在體外也能發(fā)生,，這種特性就是許多免疫檢測方法的基礎(chǔ),。抗原與抗體相互作用是非共價(jià)的,，可逆的,，其特性符合許多化學(xué)反應(yīng)的基本原理。但因?yàn)榭贵w分子的結(jié)構(gòu)特點(diǎn),，以及抗原分子結(jié)構(gòu)的多樣性,，使抗原抗體結(jié)合反應(yīng)表現(xiàn)出復(fù)雜性 。
抗體特異性與交叉反應(yīng)：抗體是特異的,。只與相應(yīng)抗原反應(yīng),。實(shí)際制備的抗體卻常有非特異性反應(yīng)，這是因?yàn)榭乖患冊斐傻?。多組分抗原之間存在共同的抗原決定簇,，或者兩個(gè)抗原決定簇結(jié)構(gòu)類似能與同一抗體結(jié)合，均可出現(xiàn)抗體與異源抗原的交叉反應(yīng),。用瓊脂雙擴(kuò)散能簡便直觀地反映不同抗原與同一抗血清,，或不同抗血清與同一抗原的交叉反應(yīng)。抗體反應(yīng)的交叉反應(yīng)指抗體除與其相應(yīng)的抗原發(fā)生特異性反應(yīng)外還與其它抗原發(fā)生反應(yīng),。產(chǎn)生的原因有以下幾個(gè)方面：
1. 抗原特異性指用于免疫動(dòng)物的抗原性物質(zhì)中含有多種抗原分子,，它引起動(dòng)物產(chǎn)生針對多種抗原分子特異性的相應(yīng)抗體。任何其它物質(zhì)只要含有一種或多種與上述物質(zhì)相同的抗原分子,，必將與上述多特異性的抗血清發(fā)生交叉反應(yīng),。
2. 共同決定簇即兩種抗原分子中都含有相同的抗原決定簇。
3. 決定簇相似,，兩種不同的抗原決定簇,，如果結(jié)構(gòu)大致相同，由于空間構(gòu)象關(guān)系,，某一決定簇的相應(yīng)抗體可以與大致相同的決定簇發(fā)生交叉反應(yīng),。當(dāng)然抗原一抗體之間構(gòu)象相似時(shí)的結(jié)合力小于吻合時(shí)的結(jié)合力。