化工儀器網(wǎng)
技術(shù)文章
酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定(ELISA）的洗滌優(yōu)化
閱讀：93 發(fā)布時(shí)間：2024-11-25 ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測(cè)定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù),。ELISA免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識(shí)別和結(jié)合原理,，對(duì)待測(cè)抗體或者抗原進(jìn)行分析測(cè)定的方法。優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌,。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號(hào),，從而增加分析的信噪比。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留,，在最后一步產(chǎn)生信號(hào),。不充分的洗滌會(huì)導(dǎo)致差異和高背景，從而帶來不理想的結(jié)果,。
在做ELISA實(shí)驗(yàn)時(shí),，洗板有兩種方法：手工法洗板和洗板機(jī)洗板。二者沒有本質(zhì)的差別,，只要操作合乎要求,，均能得到正確、可靠的結(jié)果,。
手工洗板-重點(diǎn):
手工洗板人為因素比較大,，實(shí)驗(yàn)人員必須經(jīng)驗(yàn)豐富，洗滌次數(shù)要足夠,，沖擊力又不要太大,，加入的洗液量以剛滿反應(yīng)孔為限，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈,，同時(shí)防止孔與孔之間液體交叉。洗滌結(jié)束后扣干亦非常重要,，否則易造成假陽性,。每次洗完板后,，在吸水紙上輕輕拍干，拍板時(shí)要垂直,，避免交叉感染,。用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離;吸水紙要一次性使用,，應(yīng)使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜,。酶結(jié)合物不耐干燥，特別在較高的溫度下更易失活,，所以拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短在空氣中暴露的時(shí)間,，時(shí)間越長，吸光度值越低,。
手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種方法：
浸泡式:
1.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液,；
2.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）,；
3.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔，放置1～2分鐘,，間歇搖動(dòng),，浸泡時(shí)間不可隨意縮短；
4.吸干孔內(nèi)液體,。吸干應(yīng)徹di,，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干,；
5.重復(fù)操作步驟3和4,，洗滌3～4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高,，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時(shí)間,。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯C2H4載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán)，也含親水基團(tuán),，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用,，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體。
洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%～0.2%之間,，高于0.2%時(shí),，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。
流水沖洗式:
流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水,。洗滌時(shí)附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動(dòng)淋洗,，持續(xù)沖洗2分鐘后,，吸干液體，再用蒸餾水浸泡2分鐘,，吸干即可,。浸泡式猶如盆浴，流水沖洗式則好比淋浴,，其洗滌效果更為徹di,，且也簡便、快速,。
已有實(shí)驗(yàn)表明,，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌。洗滌時(shí)設(shè)法加大水流量或加大水壓,，讓水流沖擊板孔表面,，洗滌效果更佳。
洗板機(jī)洗板-重點(diǎn):
洗板機(jī)洗板人為因素少,，速度快,，條件恒定，但是使用洗板機(jī)洗板時(shí)應(yīng)注意以下三個(gè)關(guān)鍵點(diǎn),。
洗滌參數(shù):
主要的參數(shù)是洗滌量,。自動(dòng)洗板機(jī)會(huì)分配洗滌液。如果你之前遭遇過高背景,，那么不要猶豫,，將洗滌量調(diào)為高，最好是比包被體積更高,。太少的洗滌液會(huì)讓一部分分析表面洗滌不到,，從而明顯增加背景。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同,。
江萊生物ELISA試劑盒的使用手冊(cè)中列出包被量,。我們建議使用350µl洗滌液進(jìn)行洗滌，以便清潔整個(gè)反應(yīng)孔的壁,。一般來說,，洗滌量越高，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
洗滌次數(shù):
影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量,。當(dāng)然,，洗滌次數(shù)越多，背景越低,。然而，太多次的洗滌會(huì)降低信號(hào)強(qiáng)度,，使其難以測(cè)定,。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次。不過,，一般而言,，包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少。對(duì)于用戶包被的ELISA板,，必須優(yōu)化洗滌次數(shù),。
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液。一般來說,，96孔板的每個(gè)孔能容納330至460 µl,。不過，有些自動(dòng)化洗板機(jī)可設(shè)置程序,，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個(gè)量的洗滌液,，比如1 ml。它是如何做到的呢,？其實(shí)很簡單,，就是在分液的同時(shí)打開吸液功能。換句話說,，隨著分液器分配更多的液體,，抽吸器也將液體吸出。這種技術(shù)能增加洗滌量,，但不會(huì)溢出到其他孔中,。
抽 吸:
還有一些參數(shù)會(huì)影響洗滌步驟的效果。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置,，這兩者都能調(diào)整,，以降低背景（殘留量）和差異。
殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體,，它們會(huì)增加背景信號(hào),。殘留量越小，殘留液體越少,，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少,。
吸液高度會(huì)明顯影響殘留量；如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會(huì)讓殘留量急劇增加,。反之,，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會(huì)使吸液效率降低,，殘留量增加,。
目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動(dòng)。浮動(dòng)洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動(dòng),，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜，因?yàn)槟阈枰浅Ｗ屑?xì)地調(diào)整吸液高度,。如果你們實(shí)驗(yàn)室使用幾種不同的板,，那可能會(huì)很耗時(shí)。在使用浮動(dòng)洗頭時(shí),，吸頭會(huì)降到反應(yīng)孔的底部,。調(diào)整高度就不是很重要，因此洗頭會(huì)下降到底部,。
抽吸的位置也對(duì)殘留量有著重要影響,；如果每個(gè)孔只使用一個(gè)抽吸點(diǎn)（這很常見，因?yàn)楦欤?，那么抽吸的位置需要?yōu)化,。最佳的位置取決于洗頭的性狀，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間,，即使這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置,。一般來說，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處,。
反應(yīng)孔的形狀也會(huì)影響殘留量,。C形底（平底圓角）的微孔板一般會(huì)比那些平底尖角的微孔板殘留量更低。
洗板注意：
1.需每天校正注液量及殘液量,，洗滌后殘液量不得大于2 μl,。
2.及時(shí)更換破損吸液針，避免破壞底板包被,。
3.針對(duì)不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度,，避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板。
4.注意調(diào)整洗液量,，洗液量過多將溢出,，過少將達(dá)不到洗滌效果。
5.關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道,，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道,。
6.不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用。
為了洗滌效果較好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1～2次,，能達(dá)到理想的洗滌效果。