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酶聯(lián)接免疫吸附劑測定(ELISA）的洗滌優(yōu)化
閱讀：293 發(fā)布時間：2024-11-25 ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱,。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù)。ELISA免疫分析是一種利用特定抗體與抗原或半抗原發(fā)生的高選擇性高特異性識別和結(jié)合原理,，對待測抗體或者抗原進(jìn)行分析測定的方法,。優(yōu)化ELISA的重點(diǎn)之一在于洗滌。洗滌步驟可降低未結(jié)合抗體所引起的背景信號,，從而增加分析的信噪比,。每一步之間的洗滌確保只有特異的結(jié)合事件被保留，在最后一步產(chǎn)生信號,。不充分的洗滌會導(dǎo)致差異和高背景,，從而帶來不理想的結(jié)果。
在做ELISA實(shí)驗(yàn)時,，洗板有兩種方法：手工法洗板和洗板機(jī)洗板,。二者沒有本質(zhì)的差別，只要操作合乎要求,，均能得到正確,、可靠的結(jié)果。
手工洗板-重點(diǎn):
手工洗板人為因素比較大,，實(shí)驗(yàn)人員必須經(jīng)驗(yàn)豐富,，洗滌次數(shù)要足夠，沖擊力又不要太大,，加入的洗液量以剛滿反應(yīng)孔為限,，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈，同時防止孔與孔之間液體交叉,。洗滌結(jié)束后扣干亦非常重要,，否則易造成假陽性。每次洗完板后,，在吸水紙上輕輕拍干,，拍板時要垂直，避免交叉感染,。用力不能過猛,，防止抗原抗體復(fù)合物脫離;吸水紙要一次性使用，應(yīng)使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜。酶結(jié)合物不耐干燥,，特別在較高的溫度下更易失活,，所以拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短在空氣中暴露的時間，時間越長,，吸光度值越低,。
手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種方法：
浸泡式:
1.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液；
2.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后,，即甩去）；
3.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔,，放置1～2分鐘，間歇搖動,，浸泡時間不可隨意縮短,；
4.吸干孔內(nèi)液體。吸干應(yīng)徹di,，可用水泵或真空泵抽吸,，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干；
5.重復(fù)操作步驟3和4,，洗滌3～4次（或按說明規(guī)定）,。在間接法中如本底較高，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間,。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法,。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液。聚苯C2H4載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團(tuán),，也含親水基團(tuán)，其疏水基團(tuán)與蛋白質(zhì)的疏水基團(tuán)借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,，并借助于親水基團(tuán)和水分子的結(jié)合作用，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài),，從而脫離固相載體,。
洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20，其濃度可在0.05%～0.2%之間,，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗(yàn)的靈敏度。
流水沖洗式:
流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌,，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水,。洗滌時附接一特殊裝置，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后,，吸干液體,，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可,。浸泡式猶如盆浴,，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹di,，且也簡便,、快速。
已有實(shí)驗(yàn)表明,，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌,。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面,，洗滌效果更佳,。
洗板機(jī)洗板-重點(diǎn):
洗板機(jī)洗板人為因素少，速度快,，條件恒定,，但是使用洗板機(jī)洗板時應(yīng)注意以下三個關(guān)鍵點(diǎn)。
洗滌參數(shù):
主要的參數(shù)是洗滌量,。自動洗板機(jī)會分配洗滌液,。如果你之前遭遇過高背景，那么不要猶豫,，將洗滌量調(diào)為高,，最好是比包被體積更高。太少的洗滌液會讓一部分分析表面洗滌不到,，從而明顯增加背景,。所有反應(yīng)孔的洗滌量必須相同。
江萊生物ELISA試劑盒的使用手冊中列出包被量,。我們建議使用350µl洗滌液進(jìn)行洗滌,，以便清潔整個反應(yīng)孔的壁。一般來說,，洗滌量越高,，則孵育步驟殘留的抗體或抗原量就越少。
洗滌次數(shù):
影響洗滌效果的主要參數(shù)是洗滌循環(huán)的量,。當(dāng)然,，洗滌次數(shù)越多，背景越低,。然而,，太多次的洗滌會降低信號強(qiáng)度,，使其難以測定。通常的做法是在每次抗體或抗原孵育后重復(fù)洗滌三次,。不過,，一般而言，包被平板需要的洗滌次數(shù)比用戶包被的平板要少,。對于用戶包被的ELISA板,，必須優(yōu)化洗滌次數(shù)。
控制洗滌量和洗滌次數(shù)的另一種方法是加入過量的洗滌液,。一般來說,，96孔板的每個孔能容納330至460 µl。不過,，有些自動化洗板機(jī)可設(shè)置程序,，分配遠(yuǎn)遠(yuǎn)超出這個量的洗滌液，比如1 ml,。它是如何做到的呢？其實(shí)很簡單,，就是在分液的同時打開吸液功能,。換句話說，隨著分液器分配更多的液體,，抽吸器也將液體吸出,。這種技術(shù)能增加洗滌量，但不會溢出到其他孔中,。
抽 吸:
還有一些參數(shù)會影響洗滌步驟的效果,。這些參數(shù)包括吸液高度和吸入位置，這兩者都能調(diào)整,，以降低背景（殘留量）和差異,。
殘留液體中包含未結(jié)合的抗原或抗體，它們會增加背景信號,。殘留量越小,，殘留液體越少，轉(zhuǎn)移到下一步的干擾液體也就越少,。
吸液高度會明顯影響殘留量,；如果洗滌吸頭與反應(yīng)孔底部的距離稍大，那就會讓殘留量急劇增加,。反之,，如果洗滌吸頭壓著反應(yīng)孔底部，那么也會使吸液效率降低,，殘留量增加,。
目前的洗板機(jī)一般使用兩種類型的洗頭：剛性和浮動,。浮動洗頭中的吸頭可在洗滌過程中自由上下移動，而剛性洗頭則固定在適當(dāng)?shù)奈恢?。使用剛性洗頭的洗滌操作在優(yōu)化起來更為復(fù)雜,，因?yàn)槟阈枰浅Ｗ屑?xì)地調(diào)整吸液高度。如果你們實(shí)驗(yàn)室使用幾種不同的板,，那可能會很耗時,。在使用浮動洗頭時，吸頭會降到反應(yīng)孔的底部,。調(diào)整高度就不是很重要,，因此洗頭會下降到底部。
抽吸的位置也對殘留量有著重要影響,；如果每個孔只使用一個抽吸點(diǎn)（這很常見,，因?yàn)楦欤敲闯槲奈恢眯枰獌?yōu)化,。最佳的位置取決于洗頭的性狀,，但它幾乎不在反應(yīng)孔的中間，即使這是所有洗頭最常見的默認(rèn)位置,。一般來說,，最佳位置在孔中間與孔壁之間的某處。
反應(yīng)孔的形狀也會影響殘留量,。C形底（平底圓角）的微孔板一般會比那些平底尖角的微孔板殘留量更低,。
洗板注意：
1.需每天校正注液量及殘液量，洗滌后殘液量不得大于2 μl,。
2.及時更換破損吸液針,，避免破壞底板包被。
3.針對不同廠家酶標(biāo)板注意調(diào)整吸液頭下降高度,，避免沖洗針頭卡住酶標(biāo)板,。
4.注意調(diào)整洗液量，洗液量過多將溢出,，過少將達(dá)不到洗滌效果,。
5.關(guān)機(jī)前使用蒸餾水沖洗管道，避免洗液的結(jié)晶物堵塞管道,。
6.不同種試劑盒的洗液嚴(yán)禁混合使用,。
為了洗滌效果較好，實(shí)驗(yàn)室可采用機(jī)器與人工洗滌相結(jié)合的方法,，在機(jī)器洗滌后再進(jìn)行人工洗板1～2次,，能達(dá)到理想的洗滌效果。