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ELISA檢測試劑盒操作過程技巧匯總
閱讀：232 發(fā)布時間：2024-10-28ELISA是酶聯(lián)接免疫吸附劑測定( Enzyme-Linked Immunosorbnent Assay )的簡稱。它是繼免疫熒光和放射免疫技術(shù)之后發(fā)展起來的一種免疫酶技術(shù),。在檢測時,，受檢標(biāo)本（測定其中的抗原）與固相載體表面的抗體反應(yīng)。洗滌后加入酶標(biāo)記的抗體，通過反應(yīng)結(jié)合在固相載體上,。加入酶反應(yīng)的底物后,，底物被酶催化成為有色產(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān),，可根據(jù)呈色的深淺進(jìn)行定性或定量分析,。ELISA方法被廣泛應(yīng)用于各種抗原和抗體測定。但ELISA測定中影響因素較多，而且其操作中有一定的技術(shù)要求,，在檢測過程中除正常反應(yīng)外,，有時常見到一些錯誤的結(jié)果。引起ELISA測定錯誤結(jié)果的原因主要有：①標(biāo)本因素,；②試劑因素,；③操作因素。下面就一些ELISA檢測試劑盒操作過程技巧匯總：
1．樣品稀釋
酶聯(lián)免疫反應(yīng)是一種敏感性很高的反應(yīng),，如果血清不稀釋，不可避免會產(chǎn)生很強(qiáng)的非特異性反應(yīng),，出現(xiàn)假陽性,。因此，國外檢測血清抗體的試劑盒,，均規(guī)定將血清稀釋至適當(dāng)?shù)谋稊?shù),，以降低非特異性反應(yīng)，使特異性的抗原抗體反應(yīng)充分體現(xiàn)出來,。一般產(chǎn)品的樣品稀釋倍數(shù)均通過大量試驗確定,，以保證試驗的靈敏度和特異性,。但是,，有些用戶未能嚴(yán)格按使用說明書操作，如某些產(chǎn)品應(yīng)取10μl樣品進(jìn)行稀釋,，個別用戶取5μl甚至1μl樣品進(jìn)行稀釋,，由于吸嘴上不可避免地沾有樣品以及微量移液器的精度不夠,，因此造成樣品稀釋倍數(shù)不準(zhǔn)確,，檢測結(jié)果出現(xiàn)問題。
2．試劑盒平衡
試劑盒中所有試劑和板條均應(yīng)在試驗前平衡至室溫（約25℃）,，一般需在室溫放置20～30分鐘以上,。平衡時間太短會造成試劑混勻不夠，樣品孵育時間相對縮短，ELISA反應(yīng)不夠充分,。冬季室溫低,，可將試劑盒置37℃溫箱20分鐘。
3．樣品和試劑的混勻
稀釋前,、后的樣品必須充分混勻,，所有試劑在加樣前也須搖勻，以保證試驗的均一性,。
4．加樣
在現(xiàn)在的ELISA商品試劑盒中,，必然有使用微量加樣器加入樣本的步驟。注意的關(guān)鍵點(diǎn)是：加樣不可太快,，要避免加在孔壁上部,，不可濺出和產(chǎn)生氣泡。加樣太快,，無法保證微量加樣的準(zhǔn)確性和均一性,。加在孔壁上部的非包被區(qū)，易導(dǎo)致非特異吸附,。濺出會對鄰近孔產(chǎn)生污染,。出現(xiàn)氣泡則反應(yīng)液界面有差異。所以,，有時候一份標(biāo)本用相同的試劑盒這次測定為陽性,，下次測定為陰性，往往就是上述加樣及試劑的錯誤所致,。
5．溫育
溫育是ELISA測定中影響測定成敗最為關(guān)鍵的一個因素,。ELISA作為一種固相免疫測定，抗原抗體的結(jié)合反應(yīng)在固相上進(jìn)行,，要使液相中的抗原或抗體與固相上的特異抗體或抗原全結(jié)合,，必須在一定的溫度條件下反應(yīng)一定的時間。溫育所需時間與溫度成反比,，即溫度越高,，則所需時間相對較短。最為常用的溫育溫度有37℃和室溫,，其次是43℃和2～8℃,。一些操作者，擅自改變說明書操作,，使用自己喜歡的溫育時間和溫育溫度,，這樣造成一些不必要的麻煩。因為,，不同試劑盒有不同的溫育時間和溫育溫度的選擇,，隨意更改溫育時間或者溫育溫度將導(dǎo)致試驗結(jié)果出現(xiàn)偏差,。
6．洗板
固相免疫測定技術(shù)是一種非均相免疫測定技術(shù)，需以洗滌操作將特異結(jié)合于固相的抗原或抗體與反應(yīng)溫育過程中吸附的非特異成份分離開來,，以保證ELISA測定的特異性,。洗板對于ELISA測定來說，也是極其關(guān)鍵的一步,。洗液盡量不要溢出孔外；加洗液后要靜置1分鐘,，甩去板孔中洗液后,，一定要大力拍干；及時更換吸水紙,，尤其是拍過酶標(biāo)記物的吸水紙一定要棄去,，否則可能影響試驗結(jié)果。
7．邊緣效應(yīng)
使用96孔板的ELISA測定中,，常發(fā)現(xiàn)有“邊緣效應(yīng)",，即外周孔顯色較中心孔深,。經(jīng)研究證實在溫育中的熱力學(xué)梯度可能是根本原因之所。聚苯乙烯本身為不良熱導(dǎo)體,，在實驗室的常規(guī)ELISA測定中,，將板從室溫（通常在25℃左右）置于37℃溫箱，板也升溫時,，在外周孔與中心孔之間可能存在一熱力學(xué)梯度。因此使用水浴或在將反應(yīng)溶液加入至板孔中時,，將板和溶液均加熱至溫育溫度（如37℃）,，就可以很容易地排除“邊緣效應(yīng)"，并且可提高測定的重復(fù)性,。
8．顯色
顯色一定要控制時間,根據(jù)試劑盒說明操作即可,。一般來說，顯色時間過短,，結(jié)果偏低,；顯色時間過長,，空白增高或者非特異性顯色增加,。
9．比色
比色要注意波長的選擇。以TMB為底物和以O(shè)PD為底物的試劑盒均有使用,，而前者比色波長為450nm,，后者為492nm,，濾光片需根據(jù)要求隨時更換。因此,，容易出現(xiàn)濾光片錯用的問題,。