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聚合酶鏈式反應(yīng)（PCR）常見的種類簡介
閱讀：263 發(fā)布時間：2024-10-8PCR是聚合酶鏈式反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction）的簡稱,，是一種體外擴增特定DNA片段的分子生物學技術(shù)。PCR的常見種類分述如下：
1,、普通PCR
普通PCR即一代PCR,，使用普通PCR擴增儀擴增靶基因，并通過瓊脂糖凝膠電泳對產(chǎn)物進行定性分析,。
2,、實時熒光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, qPCR）
實時熒光定量PCR，也叫Real-Time PCR,，即二代PCR，是指在PCR擴增反應(yīng)體系中加入熒光染料或者熒光基團,，在整個PCR過程中通過收集熒光信號實時監(jiān)測每一個循環(huán)中擴增產(chǎn)物量的變化,，最后通過標準曲線和CT值對待測樣品進行定量分析。qPCR常用的有兩種方法：SYBR Green法和TaqMan探針法,。
①熒光染料法（SYBR Green）：SYBR Green Ⅰ是熒光定量PCR中zui 常用的熒光染料,，它能與所有的雙鏈DNA結(jié)合。在PCR反應(yīng)體系中,，加入SYBR Green Ⅰ,，它就會在過程中與雙鏈DNA結(jié)合，從而產(chǎn)生熒光信號,。因此,，反應(yīng)中發(fā)出的全部熒光信號就會與反應(yīng)中雙鏈DNA的量呈正比，熒光強度也會隨著產(chǎn)物的增加而增加,。但是由于染料與雙鏈DNA是非特異性結(jié)合,，因此可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。
優(yōu)點：價格相對較低；使用方便,；對DNA模板沒有選擇,，通用性好；檢測靈敏度高,。
缺點：可能產(chǎn)生假陽性結(jié)果,，需要通過熔解曲線分析識別擴增產(chǎn)物的特異性；需要不斷優(yōu)化反應(yīng)體系以降低非特異性擴增,；不適合進行多重qPCR檢測,。
②熒光探針法（TaqMan技術(shù)）：TaqMan探針是最早用于定量的方法，也是臨床檢測中zui常用的檢測方法,。PCR擴增時,，加入一對引物的同時再加入一個特異性的熒光探針。該探針是一個寡核苷酸,，5'端標記一個熒光報告基團（Reporter, R）,，3'端標記一個淬滅基團（Quencher, Q）。當探針完整時,，報告基團發(fā)射的熒光信號被淬滅基團吸收,，以至于無法檢測到熒光信號；而當PCR擴增時（在延伸階段）,，探針會被Taq酶的5'→3'外切酶活性酶切降解,，使報告基團和淬滅基團分離，報告基團發(fā)射底的熒光不會再被吸收,，從而可以在熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到熒光信號,，即每擴增一條DNA，就形成一個熒光分子,，PCR產(chǎn)物的形成與熒光分子的形成wan全同步,，PCR產(chǎn)物越多，熒光信號累積的越多,，熒光強度越大,。
優(yōu)點：檢測特異性強；靈敏度高,；適合進行多重qPCR檢測,；PCR后續(xù)無需處理，節(jié)省時間和原料成本,。
缺點：需要根據(jù)不同的序列,，合成不同的探針；探針的水解依賴Taq酶外切酶的活性,，定量時容易受試劑和酶性能影響,；淬滅難以徹di,，本底較高；檢測結(jié)果很難判斷實際的擴增特性,。
熒光染料法和熒光探針法的工作原理
注：多重PCR,，也稱多重引物PCR或復(fù)合PCR，是在一個反應(yīng)體系中加入兩對以上引物,，同時擴增出多個核酸片段的一種新型PCR擴增技術(shù),。
3、數(shù)字PCR（Digital PCR, Dig-PCR, dPCR）
數(shù)字PCR即三代PCR,，是對原始PCR的另一種改進,，是一種能夠?qū)崿F(xiàn)核酸絕對定量的精準檢測技術(shù)，基于泊松分布原理將核酸樣品分配到大量獨立,、平行的微反應(yīng)單元（納升級）中,，使每個反應(yīng)室中平均只有一個拷貝或者沒有目標DNA分子，然后加入熒光信號進行擴增,，從而實現(xiàn)靶標核酸分子的絕對計數(shù),，提高檢測靈敏度和準確度。
4,、逆轉(zhuǎn)錄PCR（ReverseTranscription-PCR,RT-PCR）
逆轉(zhuǎn)錄PCR也叫反轉(zhuǎn)錄PCR,，將RNA的反轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈式擴增相結(jié)合，是PCR的一種廣泛應(yīng)用的變形,。在RT-PCR中首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶將一條單鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA,，再以cDNA為模板，擴增合成目的片段,。作為模板的RNA可以是總RNA,、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA,，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組DNA的污染,。RT-PCR技術(shù)靈敏且應(yīng)用廣泛，可用于檢測細胞中基因表達水平,，細胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列,。一般通過一步法或兩步法進行,，一步法是RT反應(yīng)和PCR反應(yīng)在同一試管中進行,；而在兩步法中兩個反應(yīng)是分開依次進行的。
5,、實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR（Real-time RT-PCR,RT-qPCR）
Real-time RT-PCR是qPCR和RT-PCR的組合,，其中的“RT"是Reverse transcription（逆轉(zhuǎn)錄）的意思，所以RT-qPCR就是結(jié)合了熒光定量技術(shù)的逆轉(zhuǎn)錄PCR,，即以mRNA或總RNA為模板,，先反轉(zhuǎn)錄得到cDNA,，再以cDNA為模板，通過熒光定量PCR進行定量檢測分析,。因為RT-PCR只可以定性,，但不能進行定量分析。與RT-PCR一樣,，RT-qPCR定量分析RNA也有兩種方法：一步法和兩步法,。兩種方法都需要先將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，然后再將其作為qPCR擴增的模板,，只是一步法中的RT和qPCR在同一試管中進行,，兩步法中的RT和qPCR是按順序分開進行。