化工儀器網
技術文章
聚合酶鏈反應(PCR)技術重難點解讀
閱讀：320 發(fā)布時間：2024-9-2 聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應。PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)：①模板核酸的制備,；②引物的質量與特異性；③酶的質量,；④PCR條件,。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析檢測,。
1、 模板
a．模板質量不佳,，含有雜蛋白質，特別是染色體中的組蛋白,；模板核酸變性不夠,；提取制備模板時丟失過多,，或吸入酚。建議選擇質量可靠的提取試劑,，重新提取高純度基因組模板；若模板為cDNA,，需要檢查逆轉錄反應及其所用RNA的純度及完整度,。
b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性，或含有Taq酶抑制劑,。
c．模板濃度過高,，或含有一些buffer,，抑制PCR擴增，如cDNA模板,，建議稀釋后再使用,。
d．靶序列變異,。如靶序列發(fā)生突變或缺失，影響引物與模板特異性結合,，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，導致PCR不能有效擴增,。
2,、引物：引物的設計,、引物質量是PCR擴增成敗的關鍵。
a．引物設計不合理,，如引物長度不夠、引物之間形成二聚體等,，需要重新設計引物,。
b．合成高質量,、高純度級別的引物。
c．引物應高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期4℃保存,，導致引物降解失效,。
3,、 酶的質量：
a．酶失活,，建議更換新酶，或新舊兩種酶同時使用,，以分析是否因酶的活性喪失或活性降低而導致沒有產物。
b．酶擴增效率低,，建議更換擴增效率高的酶,。
4,、 PCR條件:
a．PCR擴增條件：變性對PCR擴增相當重要，如變性溫度低,、變性時間短都有可能出現擴增無產物；退火溫度過低,，可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率,；退火溫度過高影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率,。
b．Mg2+濃度：Mg2+濃度對PCR擴增效率影響很大，濃度過高會降低PCR擴增的特異性,，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗。
c．反應體系：反應體系配制錯誤,，建議重復實驗,。通常進行PCR預實驗采用的是小體系,，正式實驗如需擴大體系時，一定要重新摸索條件,，否則容易出現擴增效果不理想或者失敗。
操作步驟:
準備好各種試劑和PCR儀,，就可以開始PCR實驗：將各種試劑混合并按照說明書設置PCR反應,。一般PCR循環(huán)如下：
1. 起始步驟：這對于熱啟動PCR而言是必須的,，將反應混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時間取決于所選用的DNA聚合酶,。
2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結構,，而DNA擴增需要引物與單鏈DNA模板相結合。在這一步,，反應混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA,。這是PCR循環(huán)中的第一步。
3. 退火步驟：變性之后,，DNA模板以單鏈的形式在反應混合液中存在。因為反應體系中的引物與DNA模板互補,，當反應溫度降至50-65度時,，引物與互補的序列形成氫鍵,。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度,。這一步通常維持20-40秒,，而聚合酶會結合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成,。
4. 延伸步驟：在這一步，DNA聚合酶開始DNA合成,，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的 優(yōu)溫度。通常我們選用72度,，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度。這一步與體內的DNA復制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段,。延伸時間取決于目的DNA片段的長度和DNA聚合酶的合成能力,。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長度的DNA,。
5. 第2步至第4步稱為一個循環(huán)：每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應進行30-35個循環(huán),。在前幾輪的PCR循環(huán)過程中PCR產物的量以指數速率增長，但是到了反應后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活,，反應速率逐漸下降,，因此PCR反應的產量也受到了限制。
6. 最后的延伸步驟：當30-35個循環(huán)結束后,，我們通常會以68-74度延伸5-10分鐘,，這是希望使反應體系中殘留的單鏈DNA全部反應完畢,。
7. 維持時間：通常我們設置4-10度為反應后PCR產物的保存溫度,。