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         聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)是在體外進(jìn)行的由引物介導(dǎo)的酶促DNA擴(kuò)增反應(yīng),。PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)：①模板核酸的制備,；②引物的質(zhì)量與特異性,；③酶的質(zhì)量,；④PCR條件,。尋找原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析檢測(cè),。

1、 模板
a．模板質(zhì)量不佳,，含有雜蛋白質(zhì),，特別是染色體中的組蛋白；模板核酸變性不夠,；提取制備模板時(shí)丟失過(guò)多,，或吸入酚。建議選擇質(zhì)量可靠的提取試劑,，重新提取高純度基因組模板,；若模板為cDNA，需要檢查逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)及其所用RNA的純度及完整度,。
b．模板中含有尿嘧啶抑制高保真酶的活性,，或含有Taq酶抑制劑。
c．模板濃度過(guò)高,，或含有一些buffer,，抑制PCR擴(kuò)增，如cDNA模板,，建議稀釋后再使用,。
d．靶序列變異。如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列,，導(dǎo)致PCR不能有效擴(kuò)增。

2,、引物：引物的設(shè)計(jì),、引物質(zhì)量是PCR擴(kuò)增成敗的關(guān)鍵。
a．引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長(zhǎng)度不夠,、引物之間形成二聚體等，需要重新設(shè)計(jì)引物,。
b．合成高質(zhì)量,、高純度級(jí)別的引物。
c．引物應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長(zhǎng)期4℃保存，導(dǎo)致引物降解失效,。

3,、  酶的質(zhì)量：
a．酶失活，建議更換新酶,，或新舊兩種酶同時(shí)使用,，以分析是否因酶的活性喪失或活性降低而導(dǎo)致沒有產(chǎn)物。
b．酶擴(kuò)增效率低,，建議更換擴(kuò)增效率高的酶,。

4、 PCR條件:
a．PCR擴(kuò)增條件：變性對(duì)PCR擴(kuò)增相當(dāng)重要,，如變性溫度低,、變性時(shí)間短都有可能出現(xiàn)擴(kuò)增無(wú)產(chǎn)物；退火溫度過(guò)低,，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率,；退火溫度過(guò)高影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率。
b．Mg2+濃度：Mg2+濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過(guò)高會(huì)降低PCR擴(kuò)增的特異性,，濃度過(guò)低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗。
c．反應(yīng)體系：反應(yīng)體系配制錯(cuò)誤,，建議重復(fù)實(shí)驗(yàn),。通常進(jìn)行PCR預(yù)實(shí)驗(yàn)采用的是小體系，正式實(shí)驗(yàn)如需擴(kuò)大體系時(shí),，一定要重新摸索條件,，否則容易出現(xiàn)擴(kuò)增效果不理想或者失敗。

操作步驟:
準(zhǔn)備好各種試劑和PCR儀,，就可以開始PCR實(shí)驗(yàn)：將各種試劑混合并按照說(shuō)明書設(shè)置PCR反應(yīng),。一般PCR循環(huán)如下：

1. 起始步驟：這對(duì)于熱啟動(dòng)PCR而言是必須的,，將反應(yīng)混合液加熱至94-98度以激活DNA聚合酶。這一步的時(shí)間取決于所選用的DNA聚合酶,。
2. 變性步驟：DNA本身是雙鏈結(jié)構(gòu),，而DNA擴(kuò)增需要引物與單鏈DNA模板相結(jié)合。在這一步,，反應(yīng)混合液被加熱至94-98度保持20-30秒以破壞雙鏈間的氫鍵以便釋放出單鏈DNA,。這是PCR循環(huán)中的第一步。
3. 退火步驟：變性之后,，DNA模板以單鏈的形式在反應(yīng)混合液中存在,。因?yàn)榉磻?yīng)體系中的引物與DNA模板互補(bǔ)，當(dāng)反應(yīng)溫度降至50-65度時(shí),，引物與互補(bǔ)的序列形成氫鍵,。退火溫度主要取決于引物的Tm值，通常比引物Tm值低3-5度,。這一步通常維持20-40秒,，而聚合酶會(huì)結(jié)合至引物-模板雙鏈處開始DNA合成。
4. 延伸步驟：在這一步,，DNA聚合酶開始DNA合成,，因此這一步的溫度選取的是DNA聚合酶的 優(yōu)溫度。通常我們選用72度,，但某些DNA聚合酶的最適溫度是68度,。這一步與體內(nèi)的DNA復(fù)制很相似：DNA聚合酶按照堿基互補(bǔ)規(guī)律將dNTPs加到引物的3’末端最終得到新的DNA雙鏈片段。延伸時(shí)間取決于目的DNA片段的長(zhǎng)度和DNA聚合酶的合成能力,。一般而言DNA聚合酶每60秒能夠合成1kb長(zhǎng)度的DNA,。
5. 第2步至第4步稱為一個(gè)循環(huán)：每次循環(huán)之后DNA的量均是前一次的兩倍。通常一次PCR反應(yīng)進(jìn)行30-35個(gè)循環(huán),。在前幾輪的PCR循環(huán)過(guò)程中PCR產(chǎn)物的量以指數(shù)速率增長(zhǎng),，但是到了反應(yīng)后期隨著dNTPs和引物的量的減少以及DNA聚合酶的失活，反應(yīng)速率逐漸下降,，因此PCR反應(yīng)的產(chǎn)量也受到了限制,。
6. 最后的延伸步驟：當(dāng)30-35個(gè)循環(huán)結(jié)束后，我們通常會(huì)以68-74度延伸5-10分鐘,，這是希望使反應(yīng)體系中殘留的單鏈DNA全部反應(yīng)完畢,。
7. 維持時(shí)間：通常我們?cè)O(shè)置4-10度為反應(yīng)后PCR產(chǎn)物的保存溫度。