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ELISA試驗手工洗滌操作解讀
閱讀：238 發(fā)布時間：2024-7-30洗滌在ELISA試驗過程中雖不是一個反應(yīng)步驟,，但卻也決定著實驗的成敗,。ELSIA試驗就是靠洗滌來達到分離游離的和結(jié)合的酶標記物的目的,。通過洗滌以清除殘留在板孔中沒能與固相抗原或抗體結(jié)合的物質(zhì),，以及在反應(yīng)過程中非特異性地吸附于固相載體的干擾物質(zhì),。聚苯乙烯等塑料對蛋白質(zhì)的吸附是普遍性的，而在洗滌時又應(yīng)把這種非特異性吸附的干擾物質(zhì)洗滌下來,?？梢哉f在ELISA試驗操作中，洗滌是最主要的關(guān)鍵技術(shù),。
手工洗板人為因素比較大,，實驗人員必須經(jīng)驗豐富，洗滌次數(shù)要足夠,，沖擊力又不要太大,，加入的洗液量以剛滿反應(yīng)孔為限，防止孔口內(nèi)有游離酶未能洗凈,，同時防止孔與孔之間液體交叉,。洗滌結(jié)束后扣干亦非常重要，否則易造成假陽性,。每次洗完板后,，在吸水紙上輕輕拍干，拍板時要垂直,，避免交叉感染,。用力不能過猛，防止抗原抗體復(fù)合物脫離;吸水紙要一次性使用，應(yīng)使用不易脫落碎屑的吸水紙為宜,。酶結(jié)合物不耐干燥,，特別在較高的溫度下更易失活，所以拍干的反應(yīng)板應(yīng)盡量縮短在空氣中暴露的時間,，時間越長,，吸光度值越低。
手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種方法：
一,、浸泡式
1.吸干或甩干孔內(nèi)反應(yīng)液,；
2.用洗滌液過洗一遍（將洗滌液注滿板孔后，即甩去）,；
3.浸泡,，即將洗滌液注滿板孔，放置1～2分鐘,，間歇搖動,，浸泡時間不可隨意縮短；
4.吸干孔內(nèi)液體,。吸干應(yīng)徹di,，可用水泵或真空泵抽吸，也可甩去液體后在清潔毛巾或吸水紙上拍干,；
5.重復(fù)操作步驟3和4,，洗滌3～4次（或按說明規(guī)定）。在間接法中如本底較高,，可增加洗滌次數(shù)或延長浸泡時間,。
微量滴定板多采用浸泡式洗滌法。洗滌液多為含非離子型洗滌劑的中性緩沖液,。聚苯乙烯載體與蛋白質(zhì)的結(jié)合是疏水性的,，非離子型洗滌劑既含疏水基團，也含親水基團,，其疏水基團與蛋白質(zhì)的疏水基團借疏水鍵結(jié)合,，從而削弱蛋白質(zhì)與固相載體的結(jié)合,，并借助于親水基團和水分子的結(jié)合作用,，使蛋白質(zhì)回復(fù)到水溶液狀態(tài)，從而脫離固相載體,。
洗滌液中的非離子型洗滌劑一般是吐溫20,，其濃度可在0.05%～0.2%之間，高于0.2%時,，可使包被在固相上的抗原或抗體解吸附而減低試驗的靈敏度,。
二、流水沖洗式
流水沖洗法最初用于小珠載體的洗滌，洗滌液僅為蒸餾水甚至可用自來水,。洗滌時附接一特殊裝置,，使小珠在流水沖擊下不斷地滾動淋洗，持續(xù)沖洗2分鐘后,，吸干液體,，再用蒸餾水浸泡2分鐘，吸干即可,。浸泡式猶如盆浴,，流水沖洗式則好比淋浴，其洗滌效果更為徹di,，且也簡便,、快速。
已有實驗表明,，流水沖洗式同樣也適用于微量滴定板的洗滌,。洗滌時設(shè)法加大水流量或加大水壓，讓水流沖擊板孔表面,，洗滌效果更佳,。