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PCR技術(shù)實(shí)驗(yàn)干貨分享
閱讀：175 發(fā)布時間：2024-6-3 聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction簡稱PCR）基因擴(kuò)增技術(shù)又稱無細(xì)胞分子克隆系統(tǒng)或特異性DNA序列體外引物定向酶促擴(kuò)增法,，是基因擴(kuò)增技術(shù)的一次重大革新?？蓪O微量的靶DNA特異地?cái)U(kuò)增上百萬倍,，從而大大提高對DNA分子的分析和檢測能力，能檢測單分子DNA或?qū)γ?span style="font-family:Calibri;box-sizing: border-box;">10萬個細(xì)胞中僅含1個靶DNA分子的樣品,，因而此方法立即在分子生物學(xué),、微生物學(xué)、醫(yī)學(xué)及遺傳學(xué)等多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展,。由于PCR具有敏感性高,、特異性強(qiáng)、快速,、簡便等優(yōu)點(diǎn),，已在病原微生物學(xué)領(lǐng)域中顯示出巨大的應(yīng)用價值和廣闊的發(fā)展前景。
PCR技術(shù)是由Cetus公司和加利福尼亞大學(xué)1985年聯(lián)合創(chuàng)造的,，主要貢獻(xiàn)者為Kary B mulis和HeneryA,、Erlich。該方法首先被應(yīng)用于人β-珠蛋白DNA的擴(kuò)增及鐮刀狀紅細(xì)胞貧血病的產(chǎn)前診斷,。自85年第1次報(bào)道PCR方法以來,，PCR被廣泛應(yīng)用于分子克隆、序列分析、基因突變,、遺傳病,、傳染病、性傳播性疾病及法醫(yī)判定和考古研究等多領(lǐng)域,、并發(fā)揮了越來越大的作用,。因而發(fā)明人Kary B、mulis獲1993年諾貝爾化學(xué)獎,。
為了使PCR技術(shù)在臨床上迅速得以普及,，我們對該技術(shù)的某些程序成功地作了重大改革，使PCR技術(shù)變得簡單,、微量化,、不易發(fā)生污染，從而使PCR技術(shù)常規(guī)化成為可能,。
一,、PCR技術(shù)的特點(diǎn):
1,、特異性高
報(bào)導(dǎo)的PCR所用的DNA聚合酶是大腸桿菌的DNAPolymerase I的Klenow大片段,，其酶活性在90℃會變性失活，需每次PCR循環(huán)都要重新加入Klenow大片段,，同時引物是在37℃延伸（聚合）易產(chǎn)生模板—引物之間的堿基錯配,、致特異性較差，1988年Saiki等從溫泉水中分離到的水生嗜熱桿菌中提取的熱穩(wěn)定的Taq DNA聚合酶,，在熱變性處理時不被滅活,，不必在每次循環(huán)擴(kuò)增中再加入新酶，可以在較高溫度下連續(xù)反應(yīng),，顯著地提高PCR產(chǎn)物的特異性,，序列分析證明其擴(kuò)增的DNA序列與原模板DNA一致。擴(kuò)增過程中,，單核苷酸的錯誤參入程度很低,、其錯配率一般只有約萬分之一，足可以提供特異性分析,，選用各型病毒相對的特異寡核苷酸引物,。PCR能一次確定病毒的多重感染。如用HPV11和HPV16型病毒引物檢測病婦宮頸刮片細(xì)胞可以發(fā)現(xiàn)部分病人存在HPV11和HPV16兩型的雙重感染,。
2,、高度敏感
理論上PCR可以按2n倍數(shù)擴(kuò)增DNA十億倍以上，實(shí)際應(yīng)用已證實(shí)可以將極微量的靶DNA成百萬倍以上地?cái)U(kuò)增到足夠檢測分析量的DNA,。能從100萬個細(xì)胞中檢出一個靶細(xì)胞,，或?qū)χT如病人口液等只含一個感染細(xì)胞的標(biāo)本或僅含0.01pg的感染細(xì)胞的特異性片段樣品中均可檢測。
3、快速及無放射性
一般在2小時內(nèi)約可完成30次以上的循環(huán)擴(kuò)增,，加上用電泳分析,。只需3-4小時便可完成，不用分離提純病毒,，DNA粗制品及總RNA均可作為反應(yīng)起始物,，可直接用臨床標(biāo)本如血液、體液,、尿液,、洗液、脫落毛發(fā),、細(xì)胞,、活體組織等粗制的DNA的提取液來擴(kuò)增檢測，省去費(fèi)時繁雜的提純程序,，擴(kuò)增產(chǎn)物用一般電泳分析即可,，不一定用同位素，無放射性易于推廣,。
4,、簡便
擴(kuò)增產(chǎn)物可直接供作序列分析和分子克隆，擺脫繁瑣的基因方法,，可直接從RNA或染色體DNA中或部分DNA已降解的樣品中分離目的基因,，省去常規(guī)方法中須先進(jìn)行克隆后再作序列分析的冗繁程序。已固定的和包埋的組織或切片亦可檢測,。如在PCR引物端事先構(gòu)建一個內(nèi)切酶位點(diǎn),，擴(kuò)增的靶DNA可直接克隆到M13，PUC19等相應(yīng)酶切位點(diǎn)的載體中,。
5,、可擴(kuò)增RNA或cDNA
先按通常方法用寡脫氧胸苷引物和逆轉(zhuǎn)錄酶將mRNA轉(zhuǎn)變成單鏈cDNA，再將得到的單鏈cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，即使mRNA轉(zhuǎn)錄片段只有100ngcDNA中的0.01%,，也能經(jīng)PCR擴(kuò)增1ng有242堿基對長度的特異片段，有些外顯子分散在一段很長的DNA中,，難以將整段DNA大分子擴(kuò)增和做序列分析,。若以mRNA作模板，則可將外顯子集中,，用PCR一次便完成對外顯子的擴(kuò)增并進(jìn)行序列分析,。
二、PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的分析法
PCR擴(kuò)增DNA片段只是一個重要手段,。擴(kuò)增片段的檢測和分析才是目的,，根據(jù)研究對象和目的的不同而采用不同的分析法。瓊脂糖凝膠電泳可幫助判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小，有助于擴(kuò)增產(chǎn)物的鑒定,，點(diǎn)雜交除可鑒定擴(kuò)增產(chǎn)物外,，還有助于產(chǎn)物的分型；Southern雜交分析可從非特異擴(kuò)增產(chǎn)物中鑒定出特異產(chǎn)物的大小,，增加檢測的特異性與敏感性,，最近發(fā)展的一系列產(chǎn)物分析法（PCR-ELISA,PCR-EIA,PCR-OLA等）均有助于產(chǎn)物的精確分析。
1,、凝膠電泳分析法
PCR產(chǎn)物可通過瓊脂糖凝膠或聚丙xi酰胺凝膠電泳檢測,，以前者常用，通過電泳可以判斷擴(kuò)增產(chǎn)物的大小,。在臨床檢測中,，僅通過凝膠電泳判斷擴(kuò)增片段大小即可滿足檢測的需要。通常制膠方法為100mlTBE加1.5g瓊脂糖在微波鍋內(nèi)溶解,，稍冷后倒入電泳槽,。
電泳后，用溴化乙淀染色20min,，然后用去離子水漂洗2次,，每次15min，于UV燈下觀察結(jié)果并拍照,。
凝膠電泳不僅可以鑒定產(chǎn)物的大小,，檢測擴(kuò)增的情況，還可以用來純化擴(kuò)增產(chǎn)物,。
2、點(diǎn)雜交
當(dāng)擴(kuò)增產(chǎn)物是多條帶時,，用點(diǎn)雜交更合適,。這種方法的基本過程是，首先將擴(kuò)增的DNA固定到尼龍膜或硝酸纖維素濾膜上,，再用放射性或非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的探針雜交,。點(diǎn)雜交還有助于檢測突變DNA的突變類型，用于人類遺傳病診斷和某些基因的分型,。放射性同位素32P標(biāo)記的寡核苷酸探針檢測的敏感性,、特異性和方法的可靠性均不容懷疑，對人們認(rèn)識某些疾病與基因變異的關(guān)系起了很大的作用,。但是,，由于同位素不穩(wěn)定和放射性危害，不能常規(guī)用于臨床或法醫(yī)檢驗(yàn),，用非放射性物質(zhì)（生物素,、熒光素和di高辛等）標(biāo)記的寡核苷酸探針分析PCR產(chǎn)物以確定核酸序列變異則是一種簡便而安全的方法。非放射性標(biāo)記物質(zhì)穩(wěn)定性高，使用方便,、安全,、檢測速度快。
3,、微孔板夾心雜交法
該法是通過一固定于微孔板的捕獲探針與PCR產(chǎn)物的某一區(qū)域特異雜交使產(chǎn)物間接地固定于微孔板上,。然后，再用一生物素等非放射性標(biāo)記物標(biāo)記的檢測探針與產(chǎn)物的另一區(qū)域雜交,，漂洗后顯色即可判斷結(jié)果,，該法需要兩個雜交過程來檢測一個產(chǎn)物，因此,，其特異性較一次雜交的檢測法高,。該法已用于HBV的檢測，其敏感度可達(dá)5個HBv DNA分子,。此法的敏感性和特異性與PCR 32P探針的Southern雜交法相當(dāng),。但PCR微孔板夾心雜交法操作簡便、快速,、避免了同位素標(biāo)記探針的危害,，顯色反應(yīng)類似于臨床常規(guī)應(yīng)用的ELISA,適于臨床實(shí)驗(yàn)室常規(guī)應(yīng)用。
4,、PCR-ELISA法
本法避免了電泳和雜交的步驟,，適于常規(guī)ELISA記數(shù)儀檢測。因?yàn)?span style="font-family:Calibri;box-sizing: border-box;">5'端修飾后仍可進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增特異靶序列,。因此,，可以通過修飾一個引物的5′端使其攜帶便于PCR產(chǎn)物固定的功能基因，而通過另一引物5′-端的修飾使產(chǎn)物便于檢測,。
三,、PCR實(shí)驗(yàn)中常見問題對策
所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果都有成功或失敗，實(shí)驗(yàn)的失敗可能是應(yīng)該出結(jié)果而沒有出,，我們把它稱作假陰性,，不該出結(jié)果而出了結(jié)果我們把它稱為假陽性。PCR實(shí)驗(yàn)中最常見的問題就是假陰性和假陽性問題,。
1,、假陰性
出現(xiàn)假陰性結(jié)果最常見的原因是：Taq DNA聚合酶活力不夠，或活性受到抑制,；引物設(shè)計(jì)不合理,；提取的模板質(zhì)量或數(shù)量不過關(guān)以及PCR系統(tǒng)欠妥當(dāng)；循環(huán)次數(shù)不夠,。所以在實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)假陰性失敗時,，首先在原來擴(kuò)增的產(chǎn)物中再加入Taq DNA聚合酶,、增加5-10次循環(huán)，一般都會獲得成功,。如果沒有成功應(yīng)檢查PCR擴(kuò)增儀的溫度是否準(zhǔn)確,，采集標(biāo)本是否有問題。為了防止假陰性的出現(xiàn)在選用Taq DNA聚合酶時,，要注意用活力高質(zhì)量好的酶,。同時在提取PCR模板時，應(yīng)特別注意防止污染抑制酶活性物質(zhì)（如酚,、 lv仿）的存在,。盡管Taq DNA聚合酶對模板純度要求不高，但也不允許有破壞性有機(jī)試劑的污染,。PCR擴(kuò)增的先決條件及特異性是引物與靶DNA良好的互補(bǔ),，尤其是要 保證引物的3′端與靶基因的互補(bǔ)。對變異較大的擴(kuò)增對象,，宜采用巢式（Nested）PCR或double PCR,。在進(jìn)行PCR操作時應(yīng)注意Mg2+的濃度要合理。PCR反應(yīng)的各溫度點(diǎn)的設(shè)置要合理,。
2,、假陽性
PCR結(jié)果的假陽性是對被檢測標(biāo)本而言，而反應(yīng)系統(tǒng)中所擴(kuò)增的產(chǎn)物是真實(shí)的,。因?yàn)?span style="font-family:Calibri;box-sizing: border-box;">PCR技術(shù)高度靈敏,，極其微量的靶基因污染都會造成大量擴(kuò)增，而造成結(jié)果判斷上的失誤,，所以污染是PCR假陽性的主要根源,。PCR的污染主要是標(biāo)本間的交叉污染和擴(kuò)增子的污染。出現(xiàn)假陽性結(jié)果的另一種可能是樣品中存在有靶基因的同源序列,。為了避免因污染而造成的假陽性,，PCR操作時要隔離不同操作區(qū)、分裝試劑,、簡化操作程序，使用一次性吸頭,。