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實(shí)驗(yàn)室菌種應(yīng)用全面解析
閱讀：249 發(fā)布時(shí)間：2024-4-16幾種菌株概述：
標(biāo)準(zhǔn)菌株：直接從菌種保藏機(jī)構(gòu)獲得并至少定義到屬或種的水平的菌株。通常默認(rèn)為第0代菌株,。
標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株：將標(biāo)準(zhǔn)菌株在實(shí)驗(yàn)室轉(zhuǎn)接一代后得到的一套相同的獨(dú)立菌株,。通常為第1代或第2代菌株。
儲(chǔ)備菌株：從標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株轉(zhuǎn)接一代獲得的培養(yǎng)物,。通常為第2代或第3代菌株,。
工作菌株：由標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備菌株、 儲(chǔ)備菌株或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)（經(jīng)證明或未經(jīng)證明） 轉(zhuǎn)接一代獲得的菌株,。通常為第3-5代菌,。傳代：每一次的轉(zhuǎn)接培養(yǎng)都是一次傳代的過程，可以使用液體,、固體或半固體培養(yǎng)基,。
注意事項(xiàng)：菌株傳代只能由上往下傳，儲(chǔ)備菌株可以做為工作菌株使用,，但工作菌株不能做為儲(chǔ)備菌株使用,。實(shí)驗(yàn)室使用的工作菌株一般不可超過第5代。常用培養(yǎng)基種類：斜面培養(yǎng)基,、半固體培養(yǎng)基,、液體培養(yǎng)基、平板培養(yǎng)基,。接種方法：涂布法,、劃線法、穿刺法,、直接加入法等,。
菌種的復(fù)蘇與保存應(yīng)在超凈工作臺(tái)或生物安全柜內(nèi)進(jìn)行。
一,、菌種的復(fù)蘇
把凍干菌種管,、滅菌1mL滴管、雙碟,、鑷子,、營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂斜面數(shù)支,，移入超凈工作臺(tái)或生物安全柜,。
先用砂輪將凍干菌種安瓶頸部挫出刻痕，再將凍干菌種管外壁用碘酒擦洗消毒,、稍干,，用75%乙醇棉擦凈,，放在滅菌雙碟內(nèi)，待干,。點(diǎn)燃酒精燈,，將菌種管的封口一端在火焰上，燒灼紅熱,，用滅菌滴管吸取營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基,，滴在灼熱的菌種管封口一端，使驟冷而炸裂,。
取滅菌鑷子,，在火焰旁，將炸裂的管口打開,，放入滅菌雙碟內(nèi),，另取1支滅菌滴管,，在火焰旁吸取營養(yǎng)肉湯少許,，加至菌種管底部，將凍干菌攪動(dòng)促使溶解,，隨即吸出管內(nèi)菌液,，分別接種至營養(yǎng)瓊脂斜面及普通肉湯內(nèi)，并將滴管及菌種管投入消毒液內(nèi),，將已接種的營養(yǎng)肉湯及營養(yǎng)瓊脂斜面置35~37℃培養(yǎng)22~24h,。
取出培養(yǎng)物，仔細(xì)觀察菌苔形態(tài),、有無雜菌,、涂片、革蘭氏染色鏡檢,，呈典型菌落后,，轉(zhuǎn)種3代即可應(yīng)用。如發(fā)現(xiàn)菌型不典型,，可進(jìn)行平板分離單菌落,。
二、菌種的傳代與保存
1：菌斜面（保存）
培養(yǎng)基應(yīng)新鮮制備,，如斜面已無冷凝水者,，不宜再使用。標(biāo)簽上注明菌名及接種日期,。
至冰箱取出的菌種斜面,，應(yīng)在室溫放置約30分鐘，待溫度平衡后再移入接種室或超凈工作臺(tái),。
點(diǎn)燃酒精燈,，用左手握住菌種斜面,，將管口靠進(jìn)火焰旁，右手拿接種棒后端,，將接種環(huán)燒紅30秒,，隨后將全部接種棒金屬部分在火焰上燒灼，往返通過3次,。左手將管口在火焰上旋轉(zhuǎn)燒灼,，右手用無名指、小指及掌部夾住棉塞,，撥開棉塞,，將接種環(huán)伸人管內(nèi)先在近壁的瓊脂斜面上靠一下，稍冷卻再移至菌苔上,，刮去少量菌苔,，隨即取出接種棒，并將菌種管口移至火焰旁,。
堵上棉塞,，左手將菌種管放下，取營養(yǎng)瓊脂斜面1支,，照上述操作打開棉塞,，將接種環(huán)伸入管內(nèi)至瓊脂斜面的低部，由底向上,，將接種環(huán)輕貼斜面的表面曲折移動(dòng),，使細(xì)菌劃在斜面的表面上。
取出接種棒,，在火焰旁將培養(yǎng)基管棉塞堵上,，然后將接種過細(xì)菌的接種棒在火焰上燒灼滅菌。
將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)22~24小時(shí),，霉菌管一般置20~25℃霉菌培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)7日,。取出后放人冰箱保存，一般 3個(gè)月轉(zhuǎn)種一次,。
2：菌斜面-營養(yǎng)肉湯-分離平板-菌斜面
如果菌落形態(tài)不典型可純化,，按下列方法傳代（分離菌落）：用接種環(huán)取上述菌管（斜面）菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支，已滅菌),，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí)后,，再用接種環(huán)取培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液），接種于分離平板,，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí),，用接種針選典型菌落劃線于營養(yǎng)瓊脂斜面，置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí),。一般同時(shí)接種幾支管,，其中一支用于以后菌種傳代或接種到半固體瓊脂培養(yǎng)基中,，其它用做工作菌種。
常用分離平板包括：大腸埃希菌——EMB瓊脂平板,；銅綠假單胞菌——溴化十六烷*銨瓊脂培養(yǎng)基,；金黃se葡萄球菌——甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基。
三,、菌懸液的制備
取上述培養(yǎng)好的菌種斜面移入超凈工作臺(tái)或生物安全柜,，放置室溫后，用接種環(huán)取菌苔少許接種置營養(yǎng)肉湯中(5mL/支,，已滅菌), 將已接種畢的細(xì)菌管置35~37℃培養(yǎng)18~24小時(shí),，取出備用。一般于冰箱中保存可用7天,。
四,、對照用菌液制備
取上述培養(yǎng)好的營養(yǎng)肉湯菌懸液（濃菌液1mL，加到9mL,，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻,，為10-1，再取另一只吸管吸取10-1菌液1mL加到9mL,，0.9%無菌氯化鈉溶液混勻,，為10-2……以此類推,，稀釋至含活菌數(shù)在50 ~ 100個(gè),。用平板計(jì)數(shù)。此稀釋菌液用于試驗(yàn)后加陽性對照,，可在1天內(nèi)使用,。
五、菌種保管
菌種保管應(yīng)有專人負(fù)責(zé),，保存與加鎖的冰箱中或特制的白鐵箱中加鎖置陰暗處,，確保菌種安全。因工作變動(dòng)時(shí),，必須做好交接工作,。菌種應(yīng)有詳細(xì)登記本，包括名稱,、分離日期,、鑒定日期、鑒定者,、主要鑒定性能,，并注意記錄使用、轉(zhuǎn)移及銷毀情況和原因,。各種菌種應(yīng)按規(guī)定時(shí)間定期移種,。一般每移種3次后作一次全面鑒定,。注意菌種有無污染和變異，如,，發(fā)現(xiàn)污染和變異時(shí),，應(yīng)及時(shí)更換。購置菌種,，應(yīng)有介紹信,。全部保存菌種應(yīng)具備清單，并定期向部門負(fù)責(zé)人報(bào)告,。