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ELISA酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)主要檢測(cè)方法敘述
閱讀：301 發(fā)布時(shí)間：2024-2-26ELISA（酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)）是一種免疫測(cè)定方法,，通常用于量化樣品中特定目標(biāo)的水平,。常規(guī)用于ELISAs的樣本包括血清,、血漿,、細(xì)胞培養(yǎng)上清液、細(xì)胞裂解液,、唾液,、組織裂解液和尿液。酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)通常在96孔微孔板中進(jìn)行,，微孔板上涂有對(duì)相關(guān)分析物的特異性捕獲抗體,。在與實(shí)驗(yàn)樣品、標(biāo)準(zhǔn)品或?qū)φ掌贩趸瘯r(shí),，目標(biāo)分析物被該抗體捕獲,，一個(gè)共軛的檢測(cè)抗體與目標(biāo)分析物上的不同表位結(jié)合。隨后加入底物溶液,，產(chǎn)生一個(gè)與分析物結(jié)合量成比例的信號(hào),。ELISA的三個(gè)主要方法是夾心法、間接法,、和競(jìng)爭(zhēng)法,，每種類型的ELISA都有自己的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)。
原理及操作步驟如下：
1 ,、夾心法：
原理：針對(duì)抗原分子上2個(gè)不同抗原決定簇的單克隆抗體分別作為固相抗體和酶標(biāo)抗體,，將大分子抗原分別制備固相抗原和酶標(biāo)抗原結(jié)合物。
夾心法常用于檢測(cè)大分子抗原,，一般的操作步驟為:
a. 將具有專一性的抗體固著（coating）于塑膠孔盤(pán)上,，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測(cè)檢體,，檢體中若含有待測(cè)的抗原，則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
c. 洗去多余待測(cè)檢體，加入另一種對(duì)抗原專一的一次抗體,，與待測(cè)抗原進(jìn)行鍵結(jié)
d. 洗去多余未鍵結(jié)一次抗體，加入帶有酶的二次抗體,，與一次抗體鍵結(jié)
e. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,，加入酶底物使酵素呈色，以肉眼或儀器讀取呈色結(jié)果
2,、間接法
原理：利用酶標(biāo)記的抗抗體以檢測(cè)已與固相結(jié)合的受檢抗體,。
間接法常用于檢測(cè)抗體，一般的操作步驟為：
a. 將已知的抗原固著于塑膠孔盤(pán)上,，完成后洗去多余的抗原,。
b. 加入待測(cè)檢體，檢體中若含有待測(cè)的一次抗體,，則其會(huì)與塑膠孔盤(pán)上的抗原進(jìn)行專一性鍵結(jié),。
c. 洗去多余待測(cè)檢體,，加入帶有酶的二次抗體，與待測(cè)的一次抗體鍵結(jié),。
d. 洗去多余未鍵結(jié)二次抗體,，加入酶底物使酶呈色，藉儀器（ELISA reader）測(cè)定塑膠盤(pán)中的吸光值（OD值）,，以評(píng)估有色終產(chǎn)物的含量即可測(cè)量待測(cè)抗體的含量,。
3、競(jìng)爭(zhēng)法
原理：將特異性抗體包被于固相載體表面,，經(jīng)洗滌后分成兩組：一組加酶標(biāo)記抗原和被測(cè)抗原的混合液,，另一組只加酶標(biāo)記抗原，經(jīng)孵育洗滌后加底物顯色,，這兩組底物降解量之差,，即為所要測(cè)定的未知抗原的量。
競(jìng)爭(zhēng)法是一種較少用到的ELISA檢測(cè)機(jī)制,，一般用于檢測(cè)小分子抗原,，其操作步驟為：
a. 將具有專一性的抗體固著于塑膠孔盤(pán)上，完成后洗去多余抗體
b. 加入待測(cè)檢體,，使檢體中的待測(cè)抗原與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)
c. 加入帶有酶的抗原,，此抗原也可與塑膠孔盤(pán)上的抗體進(jìn)行專一性鍵結(jié)，由于塑膠孔盤(pán)上固著的抗體數(shù)量有限,，因此當(dāng)檢體中抗原的量越多,，則帶有酶的抗原可鍵結(jié)的固著抗體就越少，亦即,，兩種抗原皆競(jìng)相與塑膠孔盤(pán)上抗體鍵結(jié),，即所謂競(jìng)爭(zhēng)法之由來(lái)。
d. 洗去檢體與帶有酶的抗原,，加入酶底物使酶呈色,，當(dāng)檢體中抗原量越多，代表塑膠孔盤(pán)內(nèi)留下之帶有酶的抗原越少,，顯色也就越淺,。
e. 當(dāng)需要偵測(cè)無(wú)法獲得兩種以上單一性抗體的抗原，或是不易得到足夠的純化抗體以固著于孔盤(pán)上時(shí),，一般會(huì)考慮使用競(jìng)爭(zhēng)法ELISA,。