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 聚合酶鏈反應(PCR)技術是在體外進行的由引物介導的酶促DNA擴增反應,。PCR實驗過程中擴增產(chǎn)物常出現(xiàn)各種問題，以下列舉解決方案供參考：

一、擴增產(chǎn)物在凝膠中涂布或成片狀條帶彌散

（1）酶量過高,。減少酶量,；酶的質(zhì)量差,，調(diào)換另一來源的酶,。

（2）dNTP濃度過高,。減少dNTP的濃度,。

（3）MgCl2濃度過高,?？蛇m當降低其用量,。

（4）模板量過多,。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng,，而基因組DNA則應<200ng,。

（5）引物濃度不夠優(yōu)化。對引物進行梯度稀釋重復PCR反應,。

（6）循環(huán)次數(shù)過多,；增加模板量減少循環(huán)次數(shù)至30，縮短退火時間及延伸時間,，或改用二種溫度的PCR循環(huán),。

（7）退火溫度過低。

（8）電泳體系有問題：

①凝膠中緩沖液和電泳緩沖液濃度相差太大,；

②凝膠沒有凝固好,；

③瓊脂糖質(zhì)量差。

（9）若為PCR試劑盒則可能：

①由于運輸儲存不當引起試劑盒失效,；

②試劑盒本身質(zhì)量有問題,，如引物選擇、循環(huán)參數(shù)等選擇不當,。

（10）降解的陳舊模板擴增也易產(chǎn)生涂布,。

二. 擴增產(chǎn)物出現(xiàn)多條帶（雜帶）

（1）引物用量偏大，引物的特異性不高,。應調(diào)換引物或降低引物的使用量,。

（2）循環(huán)的次數(shù)過多。適當增加模板的量,，減少循環(huán)次數(shù),。

（3）酶的用量偏高或酶的質(zhì)量不好，應降低酶量或調(diào)換另一來源的酶,。

（4）退火溫度偏低,，退火及延伸時間偏長。應提高退火溫度,，減少變性與延伸時間,，也可采用二種溫度的PCR擴增。以2度為梯度設計梯度PCR反應優(yōu)化退火溫度,。

（5）樣品處理不當,。

（6）Mg2+濃度偏高，因適當調(diào)整Mg2+使用濃度,。

（7）若為PCR試劑盒,，也可能時試劑盒本身質(zhì)量有問題。

（8）復制提前終止,。使用非熱啟動的聚合酶時常有發(fā)生,。冰上準備反應體系或采用熱啟動聚合酶。

（9）反應緩沖液未全融化或未充分混勻,。確保反應緩沖液融化全并全混勻,。

（10）引物特異性差,。利用BLAST檢查引物特異性或重新設計引物。

（11）引物量過多,。減少反應體系中引物的用量,。

（12）模板量過多。質(zhì)粒DNA的用量應<50ng,，而基因組DNA則應<200ng,。

（13）外源DNA污染。確保操作的潔凈,。