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     PCR反應條件的選擇技巧主要體現(xiàn)在溫度,、時間和循環(huán)次數(shù)上,，溫度過高,，延伸時間不夠都會對實驗結(jié)果有很大的影響，以下看實戰(zhàn)總結(jié)方法技巧,。

一,、溫度和時間

溫度與時間的設置： 基于PCR原理三步驟而設置變性-退火-延伸三個溫度點。在標準反應中采用三溫度點法,，雙鏈DNA在90～95℃變性,，再迅速冷卻至40 ～60℃，引物退火并結(jié)合到靶序列上,，然后快速升溫至70～75℃,，在Taq DNA 聚合酶的作用下，使引物鏈沿模板延伸,。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法,，除變性溫度外、退火與延伸溫度可合二為一,，一般采用94℃變性,，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性)。

①變性溫度與時間

變性溫度低,，解鏈不全是導致PCR失敗的最主要原因,。一般情況下，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性,，若低于93℃則需延長時間,，但溫度不能過高，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響,。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物全變性,，就會導致PCR失敗。

②退火(復性)溫度與時間

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素,。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合。由于模板DNA 比引物復雜得多,，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞,。退火溫度與時間，取決于引物的長度,、堿基組成及其濃度,，還有靶基序列的長度。對于20個核苷酸,，G+C含量約50%的引物,，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想。引物的復性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內(nèi),， 選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,，提高PCR反應的特異性,。復性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間全結(jié)合,。

③延伸溫度與時間

Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時,， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,，常用溫度為72℃，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合,。PCR延伸反應的時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段,，延伸時間1min是足夠的,。3～4kb的靶序列需3～4min；擴增10Kb需延伸至15min,。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn),。對低濃度模板的擴增，延伸時間要稍長些,。

二,、循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度,。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間,，循環(huán)次數(shù)越多，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多,。