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     PCR反應(yīng)條件的選擇技巧主要體現(xiàn)在溫度,、時間和循環(huán)次數(shù)上，溫度過高,，延伸時間不夠都會對實驗結(jié)果有很大的影響,，以下看實戰(zhàn)總結(jié)方法技巧。

一,、溫度和時間

溫度與時間的設(shè)置： 基于PCR原理三步驟而設(shè)置變性-退火-延伸三個溫度點,。在標準反應(yīng)中采用三溫度點法，雙鏈DNA在90～95℃變性,，再迅速冷卻至40 ～60℃,，引物退火并結(jié)合到靶序列上，然后快速升溫至70～75℃,，在Taq DNA 聚合酶的作用下,，使引物鏈沿模板延伸。對于較短靶基因(長度為100～300bp時)可采用二溫度點法,，除變性溫度外,、退火與延伸溫度可合二為一，一般采用94℃變性,，65℃左右退火與延伸(此溫度Taq DNA酶仍有較高的催化活性),。

①變性溫度與時間

變性溫度低，解鏈不全是導致PCR失敗的最主要原因,。一般情況下,，93℃～94℃lmin足以使模板DNA變性，若低于93℃則需延長時間,，但溫度不能過高,，因為高溫環(huán)境對酶的活性有影響。此步若不能使靶基因模板或PCR產(chǎn)物全變性,，就會導致PCR失敗,。

②退火(復(fù)性)溫度與時間

退火溫度是影響PCR特異性的較重要因素。變性后溫度快速冷卻至40℃～60℃,，可使引物和模板發(fā)生結(jié)合,。由于模板DNA 比引物復(fù)雜得多，引物和模板之間的碰撞結(jié)合機會遠遠高于模板互補鏈之間的碰撞。退火溫度與時間,，取決于引物的長度,、堿基組成及其濃度,，還有靶基序列的長度,。對于20個核苷酸，G+C含量約50%的引物,，55℃為選擇最適退火溫度的起點較為理想,。引物的復(fù)性溫度可通過以下公式幫助選擇合適的溫度：

Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)＋2(A+T)

復(fù)性溫度=Tm值-(5～10℃)

在Tm值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,，提高PCR反應(yīng)的特異性,。復(fù)性時間一般為30～60sec，足以使引物與模板之間全結(jié)合,。

③延伸溫度與時間

Taq DNA聚合酶的生物學活性：

70～80℃ 150核苷酸/S/酶分子

70℃ 60核苷酸/S/酶分子

55℃ 24核苷酸/S/酶分子

高于90℃時,， DNA合成幾乎不能進行。

PCR反應(yīng)的延伸溫度一般選擇在70～75℃之間,，常用溫度為72℃,，過高的延伸溫度不利于引物和模板的結(jié)合。PCR延伸反應(yīng)的時間,，可根據(jù)待擴增片段的長度而定,，一般1Kb以內(nèi)的DNA片段，延伸時間1min是足夠的,。3～4kb的靶序列需3～4min,；擴增10Kb需延伸至15min。延伸進間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn),。對低濃度模板的擴增,，延伸時間要稍長些。

二,、循環(huán)次數(shù)

循環(huán)次數(shù)決定PCR擴增程度,。PCR循環(huán)次數(shù)主要取決于模板DNA的濃度。一般的循環(huán)次數(shù)選在30～40次之間,，循環(huán)次數(shù)越多,，非特異性產(chǎn)物的量亦隨之增多。