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PCR反應(yīng)的基本條件溫度循環(huán)參數(shù)：

　　1．變性溫度與時(shí)間

　　PCR反應(yīng)中模板DNA的變性十分重要,。只有全性的模板DNA和PCR產(chǎn)物雙鏈全解開,，才能有效的和引物結(jié)合,。這種結(jié)合是PCR擴(kuò)增的基礎(chǔ),。變性溫度越高,，時(shí)間越長變性就越充分,。但溫度過高,、時(shí)間過長又會(huì)影響Taq DNA聚合酶的活性，所以通常選用變性溫度為95℃30s為宜,。在PCR反應(yīng)中第一個(gè)循環(huán)變性最重要,，需時(shí)間較長，因模板DNA的鏈比較長,。

　　2．復(fù)性溫度與時(shí)間

　　變性溫度是PCR反應(yīng)成敗的關(guān)鍵,，復(fù)性溫度決定著PCR的特異性。溫度越低復(fù)性越好,，但是容易出現(xiàn)引物與靶DNA的錯(cuò)配,，增加非特異性結(jié)合，溫度太高不利于復(fù)性,，大多數(shù)PCR反應(yīng)的復(fù)性溫度在55℃左右,。確定了復(fù)性溫度后，復(fù)性時(shí)間并不是關(guān)鍵因素,。但復(fù)性時(shí)間太長會(huì)增加非特異的復(fù)性,。

　　3．延伸溫度與時(shí)間

　　引物延伸溫度一般為72℃。這個(gè)溫度即考慮了Taq DNA聚合酶的活性,，又考慮到引物和靶基因的結(jié)合,。不合適的延伸溫度不僅會(huì)影響擴(kuò)增產(chǎn)物的特異性，也會(huì)影響其產(chǎn)量,，72℃時(shí),，核苷酸的合成速度為35-100個(gè)核苷酸/S，這取決于緩沖體系,、pH,、鹽濃度和DNA模板的性質(zhì)。72℃延伸1min對于長達(dá)2kb的擴(kuò)增片段是足夠的,。然而,，延伸時(shí)間過長會(huì)導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。對很低濃度底物的擴(kuò)增,，延伸時(shí)間要長些,。

　　4．循環(huán)數(shù)：

　　循環(huán)數(shù)決定著擴(kuò)增的產(chǎn)量,。在其它參數(shù)都已優(yōu)化條件下，最適循環(huán)數(shù)取決于靶序列初始濃度,。靶序列的初始濃度較低時(shí),、要增加循環(huán)次數(shù)。另外,，酶活性不好,，或量不足時(shí)也要增加循環(huán)次數(shù)、以便達(dá)到有效的擴(kuò)增量,。