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PCR 反應(yīng)特異性主要決定因素：

1引物,。引物的結(jié)構(gòu)和長度是PCR特異性的關(guān)鍵,。此外，引物濃度過高會增大形成引物二聚體的概率,，從而降低PCR特異性,。

2、復(fù)性溫度,。在Tm值允許范圍內(nèi),，選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,，提高PCR反應(yīng)的特異性。

3,、延伸時間,。延伸時間過長會導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增帶的出現(xiàn)。

4,、Mg2+濃度,。Mg2+濃度對PCR擴(kuò)增的特異性有顯著影響。Mg2+濃度過高時,，容易出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增,，使反應(yīng)特異性降低。

5,、DNA聚合酶的種類和數(shù)量,。不同種類的酶對PCR特異性的影響程度不同；酶的量過多更容易引起非特異性擴(kuò)增,。

PCR 反應(yīng)特異性提高方法：

 1. 引物的設(shè)計(jì)

　　引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設(shè)計(jì),，長度 15-30bp，GC 含量小于 60%,，3’端不超過連續(xù)三個 G 或 C,，堿基分
 

　　布錯落有致，避免引物自身形成二聚體,，設(shè)計(jì)完成之后,，需進(jìn)行 BLAST 檢測，如果與其他基因不具有互補(bǔ)性,，則可以進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn),。
 

2. 降落 PCR 

　　降落 PCR 是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR，最大的優(yōu)點(diǎn)就是可以降低實(shí)驗(yàn)耗時,，同時又可以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)的步驟,。引物的設(shè)計(jì)決定退火溫度，退火溫度過高會使 PCR 效率過低,，過低則會使非特異擴(kuò)增過多,。這雖然可以通過反復(fù)嘗試來優(yōu)化，但費(fèi)時費(fèi)力,。降落 PCR 提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法,。首先在較高的溫度下擴(kuò)增，此時雖然擴(kuò)增效率低,，但非特異擴(kuò)增基本沒有。隨著退火溫度的降低,，非特異擴(kuò)增會逐步增多,。但由于此時特異的擴(kuò)增產(chǎn)物已經(jīng)達(dá)到一定的數(shù)量優(yōu)勢,，因此會對非特異擴(kuò)增產(chǎn)生強(qiáng)烈的競爭抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率,。
 

3. 熱啟動擴(kuò)增

　　采用熱啟動方法進(jìn)行擴(kuò)增,，是除了設(shè)計(jì)最佳引物之外，提高 PCR 反應(yīng)特異性好的方式,。在一般的 PCR 反應(yīng)中,，試劑的配置需在冰上進(jìn)行，且要將 PCR 儀預(yù)熱,，這種方法就類似于熱啟動,，能夠一定程度的抑制錯配。但是酶在低溫下也存在活性,，只要體系中有 DNA 鏈存在,，就會擴(kuò)增產(chǎn)生非特異性條帶。采用熱啟動的方法就是在達(dá)到變性溫度之前wan全抑制酶的活性,，而zui有效的方法就是使用熱啟動 Taq 酶(或熱啟動高保真聚合酶)去擴(kuò)增,，它的原理就是采用化學(xué)修飾的方法封閉酶的活性中心，當(dāng)溫度上升到 95℃時恢復(fù)活性,，指導(dǎo)擴(kuò)增,。
 

4. 巢式 PCR

　　采用巢式 PCR 進(jìn)行擴(kuò)增，在多輪擴(kuò)增結(jié)果中提高擴(kuò)增特異性和靈敏度,。與普通 PCR 不同的是,，它采用兩對引物進(jìn)行擴(kuò)增，首先用第一對引物普通 PCR,，然后將第一輪擴(kuò)增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴(kuò)增,。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴(kuò)增的特異性和有限靶序列的靈敏度。