日韩av大片在线观看欧美成人不卡|午夜先锋看片|中国女人18毛片水多|免费xx高潮喷水|国产大片美女av|丰满老熟妇好大bbbbbbbbbbb|人妻上司四区|japanese人妻少妇乱中文|少妇做爰喷水高潮受不了|美女人妻被颜射的视频,亚洲国产精品久久艾草一,俄罗斯6一一11萝裸体自慰,午夜三级理论在线观看无码

PCR 反應特異性主要決定因素：

1引物。引物的結(jié)構(gòu)和長度是PCR特異性的關(guān)鍵,。此外,，引物濃度過高會增大形成引物二聚體的概率，從而降低PCR特異性,。

2,、復性溫度。在Tm值允許范圍內(nèi),，選擇較高的復性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性結(jié)合,，提高PCR反應的特異性。

3、延伸時間,。延伸時間過長會導致非特異性擴增帶的出現(xiàn),。

4、Mg2+濃度,。Mg2+濃度對PCR擴增的特異性有顯著影響,。Mg2+濃度過高時，容易出現(xiàn)非特異性擴增,，使反應特異性降低,。

5、DNA聚合酶的種類和數(shù)量,。不同種類的酶對PCR特異性的影響程度不同,；酶的量過多更容易引起非特異性擴增。

PCR 反應特異性提高方法：

 1. 引物的設(shè)計

　　引物最好在模板 cDNA 的保守區(qū)設(shè)計,，長度 15-30bp,，GC 含量小于 60%，3’端不超過連續(xù)三個 G 或 C,，堿基分
 

　　布錯落有致,，避免引物自身形成二聚體，設(shè)計完成之后,，需進行 BLAST 檢測,，如果與其他基因不具有互補性，則可以進行下一步實驗,。
 

2. 降落 PCR 

　　降落 PCR 是一種簡單的降低非特異性產(chǎn)物的 PCR,，最大的優(yōu)點就是可以降低實驗耗時，同時又可以優(yōu)化實驗的步驟,。引物的設(shè)計決定退火溫度,，退火溫度過高會使 PCR 效率過低，過低則會使非特異擴增過多,。這雖然可以通過反復嘗試來優(yōu)化,，但費時費力。降落 PCR 提供了一個較為簡易的優(yōu)化方法,。首先在較高的溫度下擴增,，此時雖然擴增效率低,，但非特異擴增基本沒有,。隨著退火溫度的降低，非特異擴增會逐步增多,。但由于此時特異的擴增產(chǎn)物已經(jīng)達到一定的數(shù)量優(yōu)勢,，因此會對非特異擴增產(chǎn)生強烈的競爭抑制，從而大幅提高 PCR 的特異性和效率。
 

3. 熱啟動擴增

　　采用熱啟動方法進行擴增,，是除了設(shè)計最佳引物之外,，提高 PCR 反應特異性好的方式。在一般的 PCR 反應中,，試劑的配置需在冰上進行,，且要將 PCR 儀預熱，這種方法就類似于熱啟動,，能夠一定程度的抑制錯配,。但是酶在低溫下也存在活性，只要體系中有 DNA 鏈存在,，就會擴增產(chǎn)生非特異性條帶,。采用熱啟動的方法就是在達到變性溫度之前wan全抑制酶的活性，而zui有效的方法就是使用熱啟動 Taq 酶(或熱啟動高保真聚合酶)去擴增,，它的原理就是采用化學修飾的方法封閉酶的活性中心,，當溫度上升到 95℃時恢復活性，指導擴增,。
 

4. 巢式 PCR

　　采用巢式 PCR 進行擴增,，在多輪擴增結(jié)果中提高擴增特異性和靈敏度。與普通 PCR 不同的是,，它采用兩對引物進行擴增,，首先用第一對引物普通 PCR，然后將第一輪擴增的產(chǎn)物稀釋 100 倍后用第二對引物(巢式引物)二次擴增,。因此采用巢式 PCR 可以大大增加困難模板擴增的特異性和有限靶序列的靈敏度,。