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    穩(wěn)定細胞株是一種常用于基因表達,、藥物篩選和蛋白質(zhì)表達等領(lǐng)域的工具,。但是，穩(wěn)定細胞株的篩選需要經(jīng)過一系列的步驟和實驗,，下面介紹一下穩(wěn)定細胞株篩選的兩種方法和穩(wěn)定細胞株的篩選簡要步驟：

一,、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染法
先把質(zhì)粒整合到染色體上后，用相應(yīng)的質(zhì)粒DNA中的抗性標(biāo)志來篩選該細胞系,，單克隆篩選穩(wěn)定細胞株,。
1、篩選濃度測定,，以10~14 天細胞全部死亡的抗生素濃度為篩選濃度,；
2、進行細胞接種,，轉(zhuǎn)染實驗前天接種細胞,，各種細胞的平板密度依據(jù)各種細胞的生長率和細胞形狀而定,。進行轉(zhuǎn)染當(dāng)天細胞密度應(yīng)達到60%~80% 覆蓋；
3,、進行細胞轉(zhuǎn)染
4,、利用質(zhì)粒上含有的抗性選擇進行篩選，并鑒定篩選結(jié)果,。

二,、慢病毒轉(zhuǎn)染法：
應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄病毒，慢病毒轉(zhuǎn)染,，篩選穩(wěn)定細胞株,。慢病毒可以攜帶外源基因隨機整合進基因組。轉(zhuǎn)染得到穩(wěn)定細胞株的效率高,，是建立穩(wěn)定株的比較不錯的方式,。
1、將人源化的抗體基因轉(zhuǎn)接到慢病毒載體上,，
2,、使用包裝細胞,，一般為293細胞,，包裝出病毒，不同類型病毒包裝時間一般在3-5天,。
3,、用病毒轉(zhuǎn)染目的細胞。包裝好的病毒要先測滴度,，根據(jù)滴度決定轉(zhuǎn)染目的細胞的病毒量,。
4、后期篩選,。轉(zhuǎn)染目的細胞1-2天后加抗生素篩選得到穩(wěn)定細胞株,。

穩(wěn)定細胞株篩選步驟：
1.構(gòu)建攜帶目標(biāo)基因的載體
首先，需要將目標(biāo)基因克隆到攜帶有選擇標(biāo)記的載體中,，例如含有抗生素抗性基因的質(zhì)粒,。然后將該載體轉(zhuǎn)染到目標(biāo)細胞中。

2.選擇標(biāo)記篩選
轉(zhuǎn)染后的細胞需要在含有抗生素的培養(yǎng)基中進行篩選,。只有成功轉(zhuǎn)染的細胞才能夠在含有抗生素的培養(yǎng)基中生長,。

3.穩(wěn)定細胞株的篩選
在完成了選擇標(biāo)記篩選后，需要對細胞進行進一步的篩選,，以得到穩(wěn)定的細胞株,。這可以通過對細胞進行單克隆分離來實現(xiàn)。具體地,，將轉(zhuǎn)染后的細胞在96孔板中進行單克隆分離,，每個孔只保留一個細胞,。然后，通過檢測細胞株的表達水平和穩(wěn)定性,，篩選出較佳的穩(wěn)定細胞株,。

總結(jié)：
穩(wěn)定細胞株的篩選是一個復(fù)雜的過程，需要仔細設(shè)計和實驗,。通過上述步驟,，可以篩選出高表達、穩(wěn)定的細胞株,，為后續(xù)的實驗和研究提供了有力的支持,。

細胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株構(gòu)建病毒法：

1、確定目標(biāo)細胞系的相關(guān)信息,，細胞的培養(yǎng)條件,，細胞的增值速度，支原體污染情況,；

2,、預(yù)實驗確定MOI值，可通過查閱文獻確定慢病毒在目標(biāo)細胞系中的MOI值也可參考查閱得到的數(shù)據(jù),，設(shè)計梯度實驗,，摸索最適MOI；

3,、預(yù)實驗確定篩選藥物用量,，常用的藥物篩選有：puro、G418,、潮霉素等,；

    4、 細胞鋪板,，將需要的細胞量接種于合適的培養(yǎng)皿中,；

    5、 細胞感染,，通過接種的細胞量及預(yù)實驗得來的MOI來計算添加的病毒體積,；

6、撤病毒,，第二天,，一般不超過24h換液；

    7,、 轉(zhuǎn)染48h后選擇對應(yīng)的抗性藥物進行篩選,；

8、篩選結(jié)束后進行單克隆化，選擇陽性克隆進行培養(yǎng),。