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IHC實驗切片染色后背景太深現(xiàn)象的原因
閱讀：948 發(fā)布時間：2023-10-30 免疫組織化學（IHC）是利用抗原抗體的特異性結(jié)合反應(yīng)來檢測和定位組織和細胞中的某些化學物質(zhì)的一門技術(shù),。全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺,，總之,，分不清那些組織陽性那些組織是陰性。切片染色后背景太深,，出現(xiàn)特異性與非特異性著色,。出現(xiàn)這種現(xiàn)象的原因有：
1、抗體濃度過高：一抗?jié)舛冗^高是常見的原因之一,。解決辦法是,，每次使用新抗體前應(yīng)當對其工作濃度進行測試，使每一抗體個體化,，找到適合自己實驗室的理想工作濃度，既使是即用型的抗體也應(yīng)如此,，不能只簡單的按說明書進行染色,。
2、抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是,，嚴格執(zhí)行操作規(guī)程,，最好隨身佩帶報時表或報時鐘，及時提醒,，避免因遺忘而造成時間延長?，F(xiàn)在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統(tǒng)的1小時,，而是30分鐘,，因此，要根據(jù)染色結(jié)果進行調(diào)整,。
3,、DAB變質(zhì)和顯色時間太長：DAB最好現(xiàn)用現(xiàn)配，如有沉渣應(yīng)進行過濾后再用,。配制好的DAB不應(yīng)存放時間太長,，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會游離出氧原子與DAB產(chǎn)生反應(yīng)而降低DAB的效力,，未用完的DAB存放在冰箱里幾天后再用這種似乎節(jié)約的辦法是不可取的,。DAB的顯色最好在顯微鏡下監(jiān)控，達到理想的染色程度時立即終止反應(yīng),。不過當染色片太多時或用染色機時,，這樣做似乎不現(xiàn)實,，但至少應(yīng)對一些新的或少用的抗體顯色時進行監(jiān)控，避免顯色時間過長,。
4,、組織變干：修復液溢出后未及時補充液體、染色切片太多,、動作太慢,、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變干的原因,。解決的辦法是操作要認真仔細,，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失,，也能提高操作速度,。
5、切片在緩沖液或修復液中浸泡時間太長（大于24小時）：原因上不清楚,，但現(xiàn)象存在,。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修復，第二天加抗體進行免疫組化染色,，如果將裝有切片和修復液的容器放在4?C冰箱過夜,，對結(jié)果無明顯影響，如果放在室溫,，特別是炎熱的夏天,，會出現(xiàn)背景著色，因此,，不可存放時間太長,。
6、一抗變質(zhì),、質(zhì)量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期,，過期的抗體要麼不顯色要麼背景著色。用新買的抗體時最好設(shè)立陽性對照和用使用過的抗體作比較,。