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    聚合酶鏈?zhǔn)絇CR反應(yīng)是一種用于放大擴(kuò)增特定的DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù),，它可看作是生物體外的特殊DNA復(fù)制,。 PCR反應(yīng)的關(guān)鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質(zhì)量與特異性,，③酶的質(zhì)量,， ④PCR循環(huán)條件,。PCR反應(yīng)出現(xiàn)假陰性,，不出現(xiàn)擴(kuò)增條帶原因亦應(yīng)針對(duì)上述環(huán)節(jié)進(jìn)行分析研究。

一,、模板：

①模板中含有雜蛋白質(zhì),，

②模板中含有Taq酶抑制劑，

③模板中蛋白質(zhì)沒有消化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，

④在提取制備模板時(shí)丟失過多，或吸入酚,。

⑤模板核酸變性不徹di,。在酶和引物質(zhì)量好時(shí)，不出現(xiàn)擴(kuò)增帶,，極有可能是標(biāo)本的消化處理,，模板核酸提取過程出了毛病，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液,，其程序亦應(yīng)固定不宜隨意更改,。
酶失活：需更換新酶，或新舊兩種酶同時(shí)使用,，以分析是否因?yàn)槊傅幕钚詥适Щ虿粔蚨鴮?dǎo)致假陰性,。需注意的是有時(shí)PCR時(shí)忘了加Taq酶或電泳時(shí)忘了加溴化乙錠。
二,、引物：

引物質(zhì)量,、引物的濃度、兩條引物的濃度是否對(duì)稱,，是PCR失敗或擴(kuò)增條帶不理想,、容易彌散的常見原因。有些批號(hào)的引物合成質(zhì)量有問題,，兩條引物一條濃度高,，一條濃度低，造成低效率的不對(duì)稱擴(kuò)增,，對(duì)策為：

①選定一個(gè)好的引物合成單位,。

②引物的濃度不僅要看OD值，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳,，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應(yīng)大體一致，如一條引物有條帶,，一條引物無條帶,，此時(shí)做PCR有可能失敗，應(yīng)和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低,，在稀釋引物時(shí)要平衡其濃度。

③引物使用過程中應(yīng)高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分,，導(dǎo)致引物變質(zhì)降解失效。

④引物設(shè)計(jì)不合理,，如引物長度不夠,，引物之間形成二聚體等。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對(duì)PCR擴(kuò)增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴(kuò)增的特異性,，濃度過低則影響PCR擴(kuò)增產(chǎn)量甚至使PCR擴(kuò)增失敗而不出擴(kuò)增條帶。
三,、反應(yīng)體積的改變：

通常進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的體積為20μl,、30μl、50μl或100μl,，應(yīng)用多大體積進(jìn)行PCR擴(kuò)增,，是根據(jù)科研和臨床檢測(cè)不同目的而設(shè)定，在做小體積如20μl后,，再做大體積時(shí),，一定要重新摸索條件，否則容易失敗,。
四,、物理原因：

溫度對(duì)PCR擴(kuò)增來說相當(dāng)重要。如果變性溫度低,，變性時(shí)間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低,，可導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增而降低特異性擴(kuò)增效率,；退火溫度過高，影響引物與模板的結(jié)合而降低PCR擴(kuò)增效率,。有時(shí)還有必要用標(biāo)準(zhǔn)的溫度計(jì),，檢測(cè)一下PCR儀或水浴鍋內(nèi)的變性、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一,。

五、靶序列變異：

如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結(jié)合,，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補(bǔ)序列，其PCR擴(kuò)增是不會(huì)成功的。