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1,、細(xì)胞復(fù)蘇

將凍存細(xì)胞從液氮中取出后，在37℃水浴鍋內(nèi)不斷搖動(dòng)促進(jìn)其融化,。移人15ml離心管中,，加入10ml預(yù)熱的DMEM wan全培養(yǎng)基，輕輕吹勻,，離心,，2000rpmX2min,，棄上清液。

加入10mlDMEM培養(yǎng)基清洗,，棄上清液,。加入10mlDMEM wan 全培養(yǎng)基，輕輕吹打,，接種于10cm盤(pán)中,，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2,、細(xì)胞傳代

細(xì)胞密度達(dá)到80%~90%時(shí)．去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次,。加入3ml含0．25%EDTA的胰蛋白酶,，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加人1mlDMEM wan全培養(yǎng)基終止胰酶消化,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,。

加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,，2000rpmX2min,，棄上清液。再加入10mlPBS（經(jīng)高壓滅菌,，保存于40C）,，吹勻，吸取10微升進(jìn)行計(jì)數(shù),，按照1×106/盤(pán)接種,，在含5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)。

3,、細(xì)胞凍存

細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時(shí),，去培養(yǎng)基，10mlPBS清洗2次,。加入3ml含0.25%EDTA的胰蛋白酶,，放人細(xì)胞培養(yǎng)箱3min。加入lmlDMEM wan全培養(yǎng)基終止胰酶消化,，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,。加入10mlPBS清洗細(xì)胞培養(yǎng)盤(pán)，轉(zhuǎn)移至15ml離心管,，2000rpmX2min,，棄上清液。

加入lml凍存液（90%血清,，10%DMSO）,，放入凍存盒內(nèi)（盒內(nèi)有異丙醇,，以保證溫度降低的速度），立即放入一80℃冰箱內(nèi),，過(guò)夜,，第二天放入液氮中，可以保存至少兩年,，如不放人液氮,，可以保存三個(gè)月。

凍存液的配制：70%的 wan全培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加,，邊滴邊搖,。

4、注意事項(xiàng)：

（1）進(jìn)入細(xì)胞間開(kāi)始細(xì)胞培養(yǎng)時(shí),，必須嚴(yán)格按照下列步驟操作：

①確定所有的細(xì)胞操作用的溶液和耗材都已經(jīng)消毒并檢測(cè)沒(méi)有問(wèn)題,，不確定的溶液和耗材請(qǐng)勿使用，除非特殊情況,，不要借用別人的溶液,。

②確定衣服的袖口已經(jīng)卷起或者白大褂的袖口已經(jīng)扎緊。

③確定酒精燈內(nèi)的酒精量,，需要的話及時(shí)進(jìn)行補(bǔ)充,。

④確定所有需要用到的溶液和耗材都放在伸手可及的位置。為了方便單手開(kāi)啟瓶蓋,，實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前可以把所有瓶蓋旋松,。

⑤盡量不要直接傾倒溶液，除非瓶口沒(méi)有被燒壞,。如果傾倒失敗，溶液粘在瓶口,，請(qǐng)用噴過(guò)75%酒精的紙巾仔細(xì)清潔瓶口周?chē)ú灰佑|到瓶口）后在火焰上簡(jiǎn)單燒灼,。

⑥操作時(shí)如果不能肯定所用的耗材是潔凈的，必須及時(shí)更換,。

⑦實(shí)驗(yàn)完畢及時(shí)收拾,，保持工作區(qū)域清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺(tái)面,。

（2）細(xì)胞污染的預(yù)防

①實(shí)驗(yàn)用品防止污染,。細(xì)胞培養(yǎng)所用試劑、耗材,、器材的清洗,、消毒要徹di，各種溶液滅菌要仔細(xì),，并在無(wú)菌實(shí)驗(yàn)檢測(cè)陰性后才能使用,。操作室及剩余的無(wú)菌器材要定期清潔,、消毒、滅菌,。

②操作過(guò)程防止污染,。

③穿著容易起靜電或吸附灰塵的衣物必須更換為白大褂后才能進(jìn)入細(xì)胞間。

④實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前需要確定戴的手套沒(méi)有問(wèn)題,，只要接觸過(guò)生物安全柜之外的物品,，必須及時(shí)對(duì)手套進(jìn)行消毒。

⑤進(jìn)入細(xì)胞培養(yǎng)間后關(guān)好門(mén),，坐下來(lái)盡量少走動(dòng)以免影響生物安全柜的風(fēng)簾,。工作開(kāi)始前要先用75%酒精棉球擦手和瓶蓋。事先要嚴(yán)格檢查所用的器材,、溶液和細(xì)胞,，不要把污染品或未經(jīng)消毒的物品帶入無(wú)菌室內(nèi)，更不能隨便使用,，以免造成大規(guī)模污染。

⑥細(xì)胞操作時(shí)動(dòng)作要輕,，必須在火焰周?chē)鸁o(wú)菌區(qū)內(nèi)打開(kāi)瓶口,，并將瓶口放在火焰周?chē)?jiǎn)單轉(zhuǎn)動(dòng)燒灼，注意不要讓火焰把塑料瓶口燒化,。

⑦實(shí)驗(yàn)操作時(shí)生物安全柜的隔板要盡可能放低,，盡量減少談話，打噴嚏或咳嗽時(shí)絕對(duì)不能對(duì)著工作區(qū),，以免造成不必要的污染,。

⑧瓶蓋應(yīng)當(dāng)?shù)狗旁谶h(yuǎn)離自己的地方，以避免瓶蓋被誤操作所污染,。

⑨不要從敞開(kāi)的容器口上方經(jīng)過(guò),，以避免衣服上掉落不明物體對(duì)細(xì)胞的污染。

⑩實(shí)驗(yàn)操作時(shí)要注意及時(shí)更換巴斯德吸管,、移液槍槍頭和移液管,，切勿一根管子做到底。一旦發(fā)現(xiàn)接觸了非潔凈或者無(wú)法確定潔凈的物品必須直接丟棄,。實(shí)驗(yàn)完畢應(yīng)及時(shí)收拾,，保持實(shí)驗(yàn)室清潔整齊，最后用75%酒精清潔臺(tái)面,。

（3）防止細(xì)胞交叉污染

①在進(jìn)行多種細(xì)胞培養(yǎng)操作時(shí),，所用器具要嚴(yán)格區(qū)分，最好作上標(biāo)記便于辨別,。按順序進(jìn)行操作,，一次只處理一種細(xì)胞,，多種細(xì)胞多種操作一起進(jìn)行時(shí)易發(fā)生t昆亂。

②在進(jìn)行換液或傳代操作時(shí),，粘有細(xì)胞的移液槍頭和移液管不要觸及試劑瓶瓶口,，以免把細(xì)胞帶到培養(yǎng)基中污染其他細(xì)胞。

③所有細(xì)胞一旦購(gòu)置,，或從別處引入,，或自己建立，必須及時(shí)保種凍存,，一旦發(fā)生污染可重新復(fù)蘇細(xì)胞,，繼續(xù)培養(yǎng)。