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       隨著溫度降低,，細胞內(nèi)的酶活性會逐漸降低，到-70℃左右,，酶活性幾乎為0,，代謝活動停止，可以實現(xiàn)長期保存,。然而,，隨著溫度降低，細胞內(nèi)外的水分也會“結(jié)冰"并形成冰晶,，冰晶能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷,、電解質(zhì)升高、滲透壓改變,、脫水,、pH改變、蛋白變性等,，能引起細胞死亡,。因此常加入冷凍保護劑甘油或二甲基亞砜（DMSO）。DMSO能快速穿透細胞膜進入細胞，降低冰點,，延緩凍存過程,，同時增加細胞膜的通透性，提高細胞內(nèi)離子濃度,，減少細胞內(nèi)冰晶的形成,，從而達到保護細胞的目的。

實驗步驟：

1. 制備凍存液,，凍存液比例：本實驗室采用70%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+20%FBS+10%DMSO,，不同實驗室及不同細胞可能略有差異，也可采用55%基礎(chǔ)培養(yǎng)基+40%FBS+5%DMSO,；

2. 取形態(tài)良好,，處于對數(shù)生長期的細胞，對其消化,、離心 (1500rpm離心8min),、計數(shù)；

3. 根據(jù)細胞數(shù)量加入對應(yīng)的凍存液,，使細胞密度維持在300-500w/mL,；

4. 小心用鑷子打開凍存管管蓋，每管分裝1-1.5mL含細胞的凍存液,，擰緊蓋管,，做好標(biāo)記。

5. 分裝好的凍存管轉(zhuǎn)入程序降溫盒后直接放-80℃過夜,；

6. 若沒有程序降溫盒,，則按下列順序依次降溫：室溫→4℃20min→-20℃30min→-80℃過夜，注意轉(zhuǎn)移過程中要保冷,，避免產(chǎn)生溫差或凍存管融化,；

7. 從-80℃冰箱取出凍存管迅速轉(zhuǎn)移到液氮長期保存。

注意事項：

1. 細胞凍存原則為“慢凍",，即讓細胞在緩慢降溫的條件下逐漸冷凍,。當(dāng)細胞快速冷凍時，水和離子往往會留在細胞中,，細胞內(nèi)冰晶的形成會撕裂和刺穿細胞膜。相反,，如果細胞冷凍太過緩慢,，則細胞外的水會在細胞內(nèi)冰形成之前結(jié)冰。這允許水通過滲透作用逸出,，但增加了可能有毒的細胞內(nèi)溶質(zhì)的濃度,。因此對于大多數(shù)細胞，最佳冷凍速率在每分鐘1℃之間。

2. DMSO能夠快速穿透細胞膜進入細胞中,，延緩溫度下降速度,，減少細胞內(nèi)冰晶的形成，從而起到保護細胞的作用,。

3. 凍存可用10%～90%的血清,，一般高濃度血清有助于維護細胞活力，此處介紹20%終濃度有利于細胞懸浮而少沉積(4℃時),，復(fù)蘇存活率在80%～90%,，對原代培養(yǎng)細胞，以90%血清凍存更為有效,。

4. 細胞離心后盡量吸干凈上清液,，減少培養(yǎng)基殘留，避免稀釋凍存液,。

5. DMSO溶于培養(yǎng)基時,，將釋放大量熱量，所以細胞凍存液需提前配制,，冷卻后再使用,，不能直接將DMSO加入含有細胞的培養(yǎng)基中，避免燙傷細胞,。

6. 細胞凍存和復(fù)蘇過程中,，不可避免會損失部分細胞，所以凍存的密度不能太低,。推薦密度為300-500w/mL,。

7. 細胞懸液加入凍存液以后盡量短時間的在常溫放置，DMSO常溫下對細胞損傷大,，分裝完成后立即轉(zhuǎn)入程序降溫盒,。