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1、A組織樣本：

迅速將新鮮的組織切成合適的大小,，在液氮中充分研磨后加裂解液裂解,，或直接加入裂解液后用勻漿器勻漿。每30-50mg組織加1ml Trizol,。

2,、B全血樣品：

加入3-5倍體積的紅細(xì)胞裂解液到血樣中，室溫孵育10min,，室溫3500rpm離心6min,。棄上清，原每2-3ml全血樣品加1mL Trizol,。

3,、C細(xì)胞樣品：

懸浮液中生長的細(xì)胞，通過離心收集細(xì)胞后,，每1×105?106細(xì)胞加入1mL Trizol,，移液器吹打混勻，直接裂解或-80℃儲(chǔ)存一個(gè)月,。貼壁生長的細(xì)胞,，有兩種處理方法。一種是移除培養(yǎng)基后,，將1mL Trizol直接加入直徑3.5cm的培養(yǎng)皿中裂解細(xì)胞,。或是先用胰蛋白酶將貼壁細(xì)胞消化下來并收集后,，再加入1mL Trizol進(jìn)行裂解,。（Note：加入Trizol前, PBS充分洗滌細(xì)胞去除殘余培養(yǎng)基,。）

4.1、 直接法

1）,、加入1ml Trizol試劑,，混勻，冰上孵育10min,。

2）,、4℃，12000rpm離心10min,，小心轉(zhuǎn)移上清液到不含顆粒的新EP管中,。

3）、加入200ul氯仿,，劇烈振蕩15秒,，室溫孵育5min。

4）,、4℃,，12000rpm離心15min?；旌弦悍秩龑樱ㄗ钕旅娴谋椒?- 氯仿有機(jī)相,，中間相和上層水相,。小心轉(zhuǎn)移上層水相到新的EP管（大約60％體積的Trizol），不要吸取中間相,，可留下少量上層液體?。∟ote：質(zhì)量比數(shù)量更重要！）

5）,、加入等體積的異丙醇,，輕輕地顛倒混勻約10次，室溫放置10min,。

6）,、4℃，12000rpm離心10min,。棄上清,，1ml 75％乙醇洗滌RNA沉淀兩次。

7）,、4℃,，12000rpm離心5min，棄上清,，室溫下風(fēng)干5-10min（不要太干,，過度干燥會(huì)導(dǎo)致RNA難溶解?。NA溶于15μl-50μlDEPC水中,。

8）,、立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長期保存,。

4.2,、 離心柱法

1）、4.1中步驟1）—4）,。

2）,、加入1/2體積的無水乙醇，輕柔顛倒混勻,。如有透明的纖維狀物體,，不影響下游步驟。

3）,、將所有裂解物/乙醇混合物轉(zhuǎn)移至離心柱,，置于2mL，靜置2min,。4℃,，12000rpm離心3min，棄廢液,。

4）,、加入500uL洗滌液，靜置2min,。4℃,，12000rpm離心30秒，棄廢液,。重復(fù)一次,。

5）、4℃,，10,000rpm離心2min以除去殘留的乙醇,。

6）、將離心柱置于新的RNase-free EP管中,，加入30ul-50ulDEPC水,，靜置5min， 12000rpm離心2min收集,。

7）,、立即進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，或先-80℃長期保存,。