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   免疫熒光技術(shù)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素,，制成熒光抗體,，再用這種熒光抗體（或抗原）作為探針檢測(cè)組織或細(xì)胞內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在組織或細(xì)胞內(nèi)形成的抗原抗體復(fù)合物上含有標(biāo)記的熒光素,，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本,，熒光素受外來(lái)激發(fā)光的照射而發(fā)生明亮的熒光（黃綠色或橘紅色）,，可以看見熒光所在的組織細(xì)胞,，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位,，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量,。

一、準(zhǔn)備好試劑與儀器：

磷酸鹽緩沖鹽水,、熒光標(biāo)記的抗體溶液,、緩沖甘油、搪瓷桶三只,、有蓋搪瓷盒一只,、熒光顯微鏡、玻片架,、濾紙,、37℃溫箱等。

二,、實(shí)驗(yàn)步驟：

1,、細(xì)胞準(zhǔn)備：對(duì)單層生長(zhǎng)細(xì)胞，在傳代培養(yǎng)時(shí),，將細(xì)胞接種到預(yù)先放置有處理過的蓋玻片的培養(yǎng)皿中,，待細(xì)胞接近長(zhǎng)成單層后取出蓋玻片，PBS洗兩次,；對(duì)懸浮生長(zhǎng)細(xì)胞,，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)細(xì)胞,，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細(xì)胞離心甩片機(jī)制備細(xì)胞片或直接制備細(xì)胞涂片,。

2,、固定：根據(jù)需要選擇適當(dāng)?shù)墓潭▌┕潭?xì)胞。固定完畢后的細(xì)胞可置于含疊氮納的PBS中4℃保存3個(gè)月,。PBS洗滌3×5 min.

3,、通透：使用交聯(lián)劑（如多聚甲醛）固定后的細(xì)胞，一般需要在加入抗體孵育前,，對(duì)細(xì)胞進(jìn)行通透處理,，以保證抗體能夠到達(dá)抗原部位。選擇通透劑應(yīng)充分考慮抗原蛋白的性質(zhì),。通透的時(shí)間一般在5-15min.通透后用PBS洗滌3×5 min.

4,、封閉：使用封閉液對(duì)細(xì)胞進(jìn)行封閉，時(shí)間一般為30min.

5,、一抗結(jié)合：室溫孵育1h或者4℃過夜,。PBST漂洗3次，每次沖洗5min.

6,、二抗結(jié)合：間接免疫熒光需要使用二抗,。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次沖洗5min后,，再用蒸餾水漂洗一次,。

7、封片及檢測(cè)：滴加封片劑一滴,，封片,，熒光顯微鏡檢查。