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   細(xì)胞凍存是細(xì)胞保存的主要方法之一,，也是保持細(xì)胞活性和增殖能力的重要手段。細(xì)胞可以通過(guò)被暫時(shí)休眠（凍存）,， 等到需要時(shí)再被輕輕喚醒（復(fù)蘇）,。低溫下，活細(xì)胞中的生物和化學(xué)反應(yīng)都會(huì)大大降低,，為細(xì)胞長(zhǎng)期凍存提供了可能,。冷凍對(duì)大多數(shù)活生物體都是致命的，細(xì)胞凍存是利用冷凍保護(hù)劑來(lái)降低冰點(diǎn)，緩慢凍結(jié)細(xì)胞的過(guò)程中,，細(xì)胞內(nèi)水分透出細(xì)胞,，使細(xì)胞凍結(jié)中冰晶形成減少，從而避免了由于冰晶形成對(duì)細(xì)胞中生命活性物質(zhì)的一系列損傷,。細(xì)胞凍存時(shí)利用低溫降低細(xì)胞代謝,，使細(xì)胞處于停止生長(zhǎng)的“休眠"狀態(tài)，等需要使用的時(shí)候再進(jìn)行復(fù)蘇操作,。細(xì)胞儲(chǔ)存在-70℃冰箱中,，可以保存一年；若儲(chǔ)存在-196℃的液氮環(huán)境中,，理論上可以實(shí)現(xiàn)長(zhǎng)期永存,。

1、細(xì)胞凍存的常見(jiàn)方法

  細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的關(guān)鍵要點(diǎn)是慢凍快融,。細(xì)胞凍存的效果主要與降溫步驟,、凍存保護(hù)液的使用、凍存溫度,、復(fù)溫速率及用于凍存的細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān),。降溫速率過(guò)快容易引起細(xì)胞內(nèi)冰晶損傷，所以為防止細(xì)胞內(nèi)結(jié)冰必須采用一個(gè)“慢"的降溫過(guò)程,，并使用凍存保護(hù)劑,，即凍存液。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜（DMSO）作保護(hù)劑,。

  根據(jù)降溫速度區(qū)分,，細(xì)胞凍存可以分為程序降溫凍存與非程序降溫凍存。傳統(tǒng)的凍存方法是將冷凍管置于4℃ 30分鐘,、-20℃ 30分鐘,、-80℃過(guò)夜再轉(zhuǎn)液氮。這種凍存方法步驟多,，而且需要遵守幾個(gè)時(shí)間點(diǎn),，容易被遺忘，對(duì)于繁忙的實(shí)驗(yàn)人員而言不那么友好,。而程序降溫方法,，采用降溫速率-1℃～-2℃/min；當(dāng)溫度達(dá)-25℃以下時(shí),，可增至-5℃～-10℃/min,，再放至-196℃液氮保存。常規(guī)的程序降溫凍存方法較為復(fù)雜,、費(fèi)時(shí),，需要儀器設(shè)備花費(fèi)較高,，所以非程序降溫凍存方法便應(yīng)運(yùn)而生，它能大大簡(jiǎn)化凍存流程,，細(xì)胞可直接置于-80°C冰箱完成凍存過(guò)程,，更為簡(jiǎn)便高效。

2,、 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇的最佳時(shí)間

細(xì)胞在體外生長(zhǎng)期間,，通常分為三個(gè)階段：潛伏期、指數(shù)生長(zhǎng)期和平臺(tái)期,。潛伏期通常是細(xì)胞剛剛傳代,，此時(shí)細(xì)胞開(kāi)始貼附基質(zhì)和伸展骨架，代謝活動(dòng)集中在粘附蛋白和骨架蛋白的表達(dá),，細(xì)胞數(shù)量在這段時(shí)間內(nèi)幾乎沒(méi)有增加,。

隨后，細(xì)胞開(kāi)始指數(shù)生長(zhǎng)期,，轉(zhuǎn)錄翻譯過(guò)程旺盛,，胞內(nèi)物質(zhì)、信號(hào)傳遞迅速,，細(xì)胞數(shù)量迅速增長(zhǎng),。如果在這個(gè)時(shí)期凍存，實(shí)際上是強(qiáng)行將細(xì)胞凍結(jié)在代謝的某一時(shí)刻,，勢(shì)必造成對(duì)解旋的DNA,、轉(zhuǎn)錄翻譯中的RNA和蛋白的機(jī)械損傷，增加個(gè)別環(huán)節(jié)發(fā)生錯(cuò)誤的風(fēng)險(xiǎn),。

隨著細(xì)胞數(shù)量的增長(zhǎng),，培養(yǎng)容器內(nèi)，細(xì)胞匯合達(dá)到90%以上,。大部分細(xì)胞因?yàn)椤敖佑|抑制"而停止高速代謝和增殖,，胞內(nèi)活動(dòng)趨于平緩。所以,，建議在剛剛進(jìn)入平臺(tái)期時(shí)凍存細(xì)胞,，既可以獲得足量的細(xì)胞，也不會(huì)對(duì)細(xì)胞造成過(guò)多的機(jī)械損傷,。

3,、細(xì)胞凍存的注意事項(xiàng)：
1.  為保持細(xì)胞最大存活率，一般都采用慢凍存融的方法,。
2.  凍存物距液氮面越近溫度越低,。標(biāo)準(zhǔn)的低凍速度為－1℃~12℃/ 分鐘，當(dāng)溫度下降達(dá)－25℃時(shí),，下降速度可增至－5~－10℃/ 分鐘,，到－100℃時(shí)則可迅速凍入液氮中。因此要適當(dāng)掌握凍存物下降入液氮中的速度,，過(guò)快能影響細(xì)胞內(nèi)水分透出,，太慢則促冰晶形成。
3.  初次凍存者在下降凍存時(shí),，宜先用細(xì)木棒伸入罐中探測(cè)液面位置,，然后需用溫度計(jì)與凍存物并行的辦法，以觀測(cè)下降凍存物的速度,、凍存物與液氮液面距離和溫度三者關(guān)系,，當(dāng)已掌握以上各參數(shù)和凍存技術(shù)熟練后，僅按下降時(shí)間和下降距離便可獲理想凍存效果,。
4.  各種細(xì)胞對(duì)凍存速度的要求也不一樣,；上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞耐受性可能大些，骨髓干細(xì)胞－2~－3℃/ 分鐘合適,；胚胎細(xì)胞耐受性較小,，不宜太快?？傊谝婚_(kāi)始時(shí),，下降速度不能超過(guò)－10℃/ 分鐘。
5.  用什么防護(hù)劑合適和用量多大,，要依細(xì)胞而定,，初代培養(yǎng)細(xì)胞用 DMSO 較好，一般細(xì)胞可用甘油,；用量以較小為好,。有人認(rèn)為人皮膚上皮細(xì)胞貯存在 20%-30% 甘油中很好。
6.  原則上細(xì)胞在液氮中可貯存多年,，但為妥善起見(jiàn),，凍存一年后，應(yīng)再?gòu)?fù)蘇培養(yǎng)一次,，然后再繼續(xù)凍存,。
7. 將凍存管放入液氮容器或從中取出時(shí)，要做好防護(hù)工作,，以免凍傷,。
8. 注意自身的安全，對(duì)于來(lái)自人源性或病毒感染的細(xì)胞株應(yīng)特別小心,。操作過(guò)程中,，應(yīng)避免引起氣溶膠的產(chǎn)生，小心有毒性試劑例如 DMSO,，并避免尖銳物品傷人等,。