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假陰性,，不出現(xiàn)擴增條帶
PCR反應的關鍵環(huán)節(jié)有①模板核酸的制備,，②引物的質量與特異性,，③酶的質量,， ④PCR循環(huán)條件,。尋找原因亦應針對上述環(huán)節(jié)進行分析研究。
一,、模板：

①模板中含有雜蛋白質,，

②模板中含有Taq酶抑制劑，

③模板中蛋白質沒有消化除凈,，特別是染色體中的組蛋白,，

④在提取制備模板時丟失過多，或吸入酚,。

⑤模板核酸變性不徹di,。在酶和引物質量好時，不出現(xiàn)擴增帶，極有可能是標本的消化處理,，模板核酸提取過程出了毛病,，因而要配制有效而穩(wěn)定的消化處理液，其程序亦應固定不宜隨意更改,。
酶失活：需更換新酶,，或新舊兩種酶同時使用，以分析是否因為酶的活性喪失或不夠而導致假陰性,。需注意的是有時PCR時忘了加Taq酶或電泳時忘了加溴化乙錠,。
二、引物：

引物質量,、引物的濃度,、兩條引物的濃度是否對稱，是PCR失敗或擴增條帶不理想,、容易彌散的常見原因,。有些批號的引物合成質量有問題，兩條引物一條濃度高,，一條濃度低,，造成低效率的不對稱擴增，對策為：

①選定一個好的引物合成單位,。

②引物的濃度不僅要看OD值,，更要注重引物原液做瓊脂糖凝膠電泳，一定要有引物條帶出現(xiàn),，而且兩引物帶的亮度應大體一致,，如一條引物有條帶，一條引物無條帶,，此時做PCR有可能失敗，應和引物合成單位協(xié)商解決,。如一條引物亮度高,，一條亮度低，在稀釋引物時要平衡其濃度,。

③引物使用過程中應高濃度小量分裝保存,，防止多次凍融或長期放冰箱冷藏部分，導致引物變質降解失效,。

④引物設計不合理,，如引物長度不夠，引物之間形成二聚體等,。
Mg2+濃度：Mg2+離子濃度對PCR擴增效率影響很大,，濃度過高可降低PCR擴增的特異性，濃度過低則影響PCR擴增產量甚至使PCR擴增失敗而不出擴增條帶。
三,、反應體積的改變：

通常進行PCR擴增采用的體積為20μl,、30μl、50μl或100μl,，應用多大體積進行PCR擴增,，是根據(jù)科研和臨床檢測不同目的而設定，在做小體積如20μl后,，再做大體積時,，一定要重新摸索條件，否則容易失敗,。
四,、物理原因：

溫度對PCR擴增來說相當重要。如果變性溫度低,，變性時間短,，極有可能出現(xiàn)假陰性；退火溫度過低,，可導致非特異性擴增而降低特異性擴增效率,；退火溫度過高，影響引物與模板的結合而降低PCR擴增效率,。有時還有必要用標準的溫度計,，檢測一下PCR儀或水浴鍋內的變性、退火和延伸溫度,，這也是PCR失敗的原因之一,。

五、靶序列變異：

如靶序列發(fā)生突變或缺失,，影響引物與模板特異性結合,，或因靶序列某段缺失使引物與模板失去互補序列，其PCR擴增是不會成功的,。