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冷凍切片實(shí)驗(yàn)操作步驟及注意點(diǎn)
閱讀:2369 發(fā)布時(shí)間:2022-1-20操作步驟:
1、取出組織支承器,,放平擺好組織,,周邊滴上包埋劑,速放于冷凍臺(tái)上冰凍,,用吸熱器壓住組織,,至包埋劑與組織凍結(jié)成白色冰體即可切片(1~3分種)。
2,、將冷凍好的組織塊,,夾緊于切片機(jī)持承器上,啟動(dòng)粗進(jìn)退鍵,,轉(zhuǎn)動(dòng)旋鈕,,將組織修平。
3,、調(diào)好欲切的厚度,根據(jù)不同的組織而定,,原則上是細(xì)胞密集的薄切,,纖維多細(xì)胞稀的可稍為厚切,,一般在5 ~10μm間。
4,、調(diào)好防卷板,。制作冰凍切片,關(guān)鍵在于防卷板的調(diào)節(jié)上,,這就要求操作者要細(xì)心,,準(zhǔn)確地將其調(diào)較好,調(diào)校至適當(dāng)?shù)奈恢?。切片時(shí),,以切出完整、平滑的切片為準(zhǔn),。切好的組織在干凈的玻片上黏附時(shí)順著一個(gè)方向稍微用力輕輕一帶 ,可避免組織攤片過程中皺折 ,保證組織結(jié)構(gòu)的完整及切片的美觀,。
注意點(diǎn):
①包埋劑的選用:包埋劑是對(duì)冷凍切片質(zhì)量一重要影響因素,包埋劑用量要適宜,,過多或過少都會(huì)影響標(biāo)本冷凍質(zhì)量,。常用的有三種包埋劑OCT劑、B超藕合劑以及普通膠水,。B超藕合劑適用于細(xì)胞豐富質(zhì)地較嫩的組織,普通膠水或 OCT劑適用于纖維豐富質(zhì)地偏硬組織,。(OCT包埋劑驟冷時(shí)固化,其冷凍速度和軟硬韌度與組織相近,,其還具有水溶性,,不影響染色等優(yōu)點(diǎn)。)
②組織塊過?。合葘⑸倭磕z擠在托架上預(yù)先放在冰凍機(jī)中冷凍,約30秒鐘左右待膠凝固時(shí)將小組織放上,組織周圍再加一些膠,再次置于冷凍機(jī)中冷凍,這樣組織被墊高,就能快速切出高質(zhì)量的切片,。
③冷凍箱及冷凍頭的溫度高低,要根據(jù)不同的組織而定,。溫度過低會(huì)導(dǎo)致組織塊過硬,切片碎裂,出現(xiàn)梯田狀薄厚不均或空洞;反之,溫度過高,組織塊硬度不夠 ,切片不易成形或成皺褶,。數(shù)據(jù)圖1供參考。
④當(dāng)切片時(shí),,如果發(fā)現(xiàn)冰凍過度時(shí),,可將冰凍的組織連同支承器取出來,在室溫停留片刻,,再行切片,,或者用口中哈氣,或者用大拇指按壓組織塊,,以此來軟化組織,,再行切片。另者,調(diào)高冰凍點(diǎn),。
⑤用于附貼切片的載玻片,,不能存放于冷凍處,于室溫存放即可,。因?yàn)楫?dāng)附貼切片時(shí),,從室溫中取出的載玻片與冷凍箱中的切片有一種溫度差,當(dāng)溫度較高的載玻片附貼上溫度較低的切片時(shí),,由于兩種物質(zhì)間溫度的差別,,當(dāng)它們碰撞在一起時(shí),分子彼此間發(fā)生轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生了一種吸附力,,使切片與載玻片牢固地附貼在一起,。如果使用冷藏的載玻片來附貼切片,由于溫度相同,,沒有發(fā)生上述的現(xiàn)象,。