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逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR原理:

提取組織或細(xì)胞中的總RNA,，以其中的mRNA作為模板,，采用Oligo(dT)或隨機引物利用逆轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄成cDNA。再以cDNA為模板進行PCR擴增,，而獲得目的基因或檢測基因表達,。RT-PCR使RNA檢測的靈敏性提高了幾個數(shù)量級,，使一些極為微量RNA樣品分析成為可能,。

逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR操作步驟：

一、RNA逆轉(zhuǎn)錄cDNA（反應(yīng)體系要20ul）依次加入

1,、Oligo（dT）加入1ul,。

2、RNA（體積即上一步驟計算出來的）

3,、剩下的用無Rnase水補齊共12ul 65℃水浴5min,。

二、加入逆轉(zhuǎn)錄試劑

1,、5×Reaction Buffer                4ul

2,、Ribolock RNase Inhibiter     1ul

3、10mM Dntp  mix                   2ul

4,、RevertAid m-mul URT          1ul

三,、設(shè)置儀器，按照說明書設(shè)置

1,、oligodT：42℃  60min

2,、逆轉(zhuǎn)錄：70℃  5min

3、終止：4℃

附加：cDNA可以跑電泳看一下,，取cDNA 1ul加load buffer（看這個是幾乘的）混勻,，跑電泳，marker用2000的取6ul左右膠板的制作,，后面有說明,。

四、PCR cDNA擴增目的基因（反應(yīng)體系是20ul,，不夠用無菌水補齊）

下面的實驗用高壓過的槍頭和普通高壓過的水即可,。（所用以下配比物品都要在冰箱中凍存，使用之前離心,，甩下來即可,。量大的話可以先加樣配比，即把所需要的試劑總量計算出后,，取出放在ep管中,。）

1、加樣：①Mix 10ul   ②引物 1ul    ③cDNA和水總計9ul

2、混勻：小離心機甩一下即可

3,、放入PCR儀：PCR儀事先設(shè)定條件,，反應(yīng)條件根據(jù)mix說明書來設(shè)定

4、PCR產(chǎn)物保存：一般在4℃冰箱保存,，長時間不用可-20℃凍存,。

五、配膠和跑膠:

1,、配膠: （水平膠,；瓊脂糖凝膠）要帶手套，TAE有毒,。

小膠板8孔的  TAE 25ml 瓊脂糖 0.25～0.30g

中膠板25孔的 TAE 50ml 瓊脂糖 0.50～0.55g

步驟：稱取BIOWEST AGAROSE（瓊脂糖）放入配膠專用燒瓶→用配膠專用量筒量1×TAE倒入燒瓶→酒精燈加熱(以看到冒泡為準(zhǔn))→將沸騰的液體轉(zhuǎn)移到EB污染區(qū)的燒瓶中→加入EB或EB替代（觀察顏色不是很深即可,，一般小膠板3滴左右）→插梳子→倒入電泳槽(倒膠從一個角倒入防止產(chǎn)生氣泡)→待膠凝固30分鐘左右拔出梳子進行跑膠(如不馬上跑將膠放4℃冰箱保存,防止膠變干)。

2,、跑膠:

（1）電泳緩沖液用1×TAE,一般跑5-8次膠后就要重新?lián)Q電泳緩沖液,。

（2）要讓緩沖液沒過膠。

（3）Marker標(biāo)記染色體上一個可以被識別的區(qū)域,，我們用的是2000的（保存在4℃冰箱中）：3-6ul單格加入,。

步驟：取PCR產(chǎn)物（cDNA）8ul，加入單格上,，接通電源,，跑膠。（注意：跑膠方向是從負(fù)極到正極）,當(dāng)loading Buffer跑到2/3時停止跑膠（大約40分鐘）,，帶手套取膠放在照相臺上,。

六、照相