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1,、如何確定引物的濃度,？

前面我們說到,，引物一般交由試劑公司合成，有時(shí)候具體的濃度我們也不能確定,。有些人喜歡稀釋十倍,，有些人喜歡稀釋二十倍。我個(gè)人認(rèn)為比較穩(wěn)妥的做法是在每次拿到反轉(zhuǎn)的 cDNA 后,，先會(huì)稀釋 3 倍左右,，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循環(huán)數(shù)一般為 25 循環(huán),，鑒定一下具體濃度,，再?zèng)Q定最后的稀釋倍數(shù)。

2,、合成的引物是我們想要的引物嗎,？

一般來說在拿到很多引物的時(shí)候，可以通過普通的 PCR 看看是否是單一條帶,，鑒定一下引物的特異性,。如果實(shí)驗(yàn)室不差錢,，則可以通過溶解曲線對(duì)所有的引物的特異性做一次鑒定。

3,、操作過程中需要注意哪些問題,？

一定要戴手套，戴手套,，戴手套,，重要的事情說三遍。根據(jù)經(jīng)驗(yàn),，少量模板的加入,，容易造成加樣誤差。所以為了盡量減少加入少量模板造成的誤差,，我們一般會(huì)將樣本再稀釋一倍,，加樣的時(shí)候多加一倍，減少 H2O  的加入量,。

4,、你確定你的 PCR 板和儀器配套嗎？

你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 儀器,，那么你一定要買配套該儀器的 qRT-PCR 板,。因?yàn)椴患嫒莸?PCR 板會(huì)導(dǎo)致結(jié)果偏差。這種狀況實(shí)驗(yàn)小白尤其需要注意,。

5,、凝膠放入電泳槽有什么注意事項(xiàng)嗎？

凝膠放入電泳槽時(shí)一定要注意方向,，核酸是帶負(fù)電的,，所以電泳的方向是從負(fù)極向正極跑，因此,，加樣孔一定要對(duì)著負(fù)極放置,，不然樣本就跑到膠外面去了。