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人淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞永生化

一,、細(xì)胞基本屬性

細(xì)胞詳述

淋巴管由毛細(xì)淋巴管匯合而成,。其形態(tài)結(jié)構(gòu)與靜脈相似,，但管徑較細(xì)，管壁較薄,。淋巴管根據(jù)其位置分為淺,、深二種。 它們管位于皮下,，常與淺靜脈伴行,，收集皮膚和皮下組織的淋巴,。淋巴管在向心行程中，通常經(jīng)過一個或多個淋巴結(jié),，從而把淋巴細(xì)胞帶入淋巴液,。淋巴系統(tǒng)對于維持人體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，引流組織間隙的體液,，免疫功能的發(fā)揮具有重要的意義,，這些功能的發(fā)揮與淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞的功能密切相關(guān)。同時在炎癥及腫瘤過程中,，淋巴管生成參與了組織的修復(fù)及腫瘤的轉(zhuǎn)移,。

該細(xì)胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。

注意事項：  收到細(xì)胞后第一次傳代建議1：2傳代,，充液培養(yǎng)基是維持培養(yǎng)基,，不能用來培養(yǎng)細(xì)胞。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出,，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定,。

實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二、在超凈工作臺中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中，去除小腦和間腦,。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四,、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì),。

五、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶,，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h。

六,、室溫1 000×g離心8min,，去上清液。

七,、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻，1 000×g,，20min,，4℃離心，去上清,。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶，0.05-0.1％I型膠原酶,，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻，37℃水浴消化0.5-1h,，700×g室溫離心6min,，去上清液。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min,，4℃),，1000×g，4℃離心10min,。

十,、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min,，室溫)，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中,，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細(xì)胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片,，記錄細(xì)胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通；由于運(yùn)輸?shù)脑?，個別敏感細(xì)胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細(xì)胞的具體情況,，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決。
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