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鴨腦微血管內(nèi)皮細胞永生化

一,、細胞基本屬性

細胞詳述

腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障的主要組成成分，能夠限制可溶性物質(zhì)和細胞等從血液進入大腦,。大腦微血管內(nèi)皮細胞與外周內(nèi)皮細胞相比具有一些相同特性,。

腦微血管內(nèi)皮細胞存在許多細胞間緊密連接，產(chǎn)生很高的跨內(nèi)皮阻抗,，延遲細胞旁的通量,；腦微血管的內(nèi)皮細胞間銜接得十分緊密，不象其他組織的血管內(nèi)皮細胞那樣有較大的縫隙腦微血管內(nèi)皮細胞缺乏內(nèi)皮細胞的窗孔結構,，其液相物質(zhì)胞飲水平較低,；腦微血管內(nèi)皮細胞具有不對稱定位酶和載體介導轉(zhuǎn)運系統(tǒng),，從而產(chǎn)生 “兩極分化"的表現(xiàn)型。 與外周內(nèi)皮細胞相同,，大腦微血管內(nèi)皮細胞表面表達細胞粘附分子,，調(diào)控白細胞進入大腦。由于微血管內(nèi)皮細胞的器官特異性,，內(nèi)皮細胞通常取源于疾病研究的相關組織,。

該細胞通過慢病毒轉(zhuǎn)染的方式攜帶SV40基因。

注意事項：  收到細胞后第一次傳代建議1：2傳代,，充液培養(yǎng)基是維持培養(yǎng)基,，不能用來培養(yǎng)細胞。

細胞特性

1) 組織來源于實驗動物的腦組織,。

2) 細胞鑒定：血管假性血友病因子（vWF）免疫熒光染色為陽性,。

3) 經(jīng)鑒定細胞純度高于90%。

4) 不含有 HIV-1,、 HBV,、HCV、支原體,、細菌,、酵母和真菌。

5) 細胞生長方式：鋪路石狀細胞,，不規(guī)則細胞,，貼壁培養(yǎng)。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機體中取出,，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定,。

實驗步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二,、在超凈工作臺中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四,、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液。

九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g，60min,，4℃),，1000×g，4℃離心10min,。

十,、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中，置于37℃,、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液。

注意事項：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。

2. 在細胞培養(yǎng)過程中,，請注意保持無菌操作。

3. 傳代培養(yǎng)過程中,，yi酶消化時間不宜過長,，否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài)。

4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片,，記錄細胞狀態(tài),，便于和技術部溝通；由于運輸?shù)脑?，個別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請及時和我們聯(lián)系，詳盡告知細胞的具體情況,，以便我們的技術人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決。
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