詳細介紹
大鼠海綿體平滑肌細胞
一,、細胞基本屬性
細胞名稱 | 大鼠海綿體平滑肌細胞 | 商品貨號 | A01X1623 |
組織來源 | 海綿體組織 | 種屬來源 | 大鼠 |
產(chǎn)品規(guī)格 | 5×105cells/T25細胞培養(yǎng)瓶 | 生長特性 | 貼壁 |
換液頻率 | 每2-3天換液一次 | 細胞形態(tài) | 成纖維細胞樣 |
培養(yǎng)基:含FBS,、生長添加劑、Penicillin,、Streptomycin等
包被條件:鼠尾膠原Ⅰ(2-5μg/cm2)
傳代特性:可傳3-5代左右,;3代以內(nèi)狀態(tài)佳
消化液:0.25%胰dan白酶
培養(yǎng)條件:氣相:空氣,95%,;CO2,,5%
傳代比例:1:2
細胞簡介:大鼠海綿體平滑肌細胞分離自海綿體組織;海綿體,,又稱海綿體肌,,是硬的平滑肌和結(jié)締組織。海綿體是一種勃起組織,,外面包有堅厚的白膜,,內(nèi)部由結(jié)締組織和平滑肌組成海綿狀支架,其腔隙與血管相通,。它主要包括海綿體內(nèi)皮細胞,、平滑肌細胞和成纖維細胞3種細胞成分。其中平滑肌細胞和成纖維細胞鑲嵌于海綿體細胞外基質(zhì)的膠原中,,在消化海綿體組織時,,膠原酶的作用主要是松解海綿體內(nèi)皮細胞與基膜的聯(lián)系,破壞海綿體內(nèi)皮細胞間的緊密連接,。因此可用膠原酶分離出海綿體平滑肌細胞,。平滑肌,是非橫紋肌的肌肉組織,。分布在人體動脈和靜脈血管壁,、膀胱、子宮,、男性和女性生殖道,、消化道、呼吸道,、眼睛的睫狀肌和虹膜,。平滑肌細胞原代分離培養(yǎng)3天后,可見細胞貼壁伸展,,細胞形態(tài)大小不一,呈梭形,、不規(guī)則形,、三角形或扇形,核卵圓形、居中,;2周后細胞匯合,,多數(shù)細胞伸展呈長梭形,胞漿豐富,,有分枝狀突起,,細胞平行排列成單層或部分區(qū)域多層重疊生長,高低起伏,;細胞密度低時,,常交織成網(wǎng)狀;密度高時,,則排列為旋渦狀或柵欄狀,。傳代后細胞生長較快,4-6天即可匯合,,并保持上述形態(tài)學特征和生長特點,。
原代細胞分離培養(yǎng)的思路:
取材--分離--培養(yǎng)--鑒定
首先將組織從機體中取出,經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細胞,,再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),,使細胞繁殖到一定系數(shù)后進行細胞鑒定。
實驗步驟:
一,、取7-10d雄性SD大鼠,,頸椎脫臼處死,浸泡于75%乙醇消毒3-5min。
二,、在超凈工作臺中,,將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,,去除小腦和間腦,。
三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動以去除軟腦膜和腦膜大血管,,再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。
四、用細解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,,保留大腦皮質(zhì)。
五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,,剪碎成約1mm3大小,放入50ml的離心管中,,加入混合酶液I(0.05-0 .1%II型膠原酶,,0 .025-0 .05%IV型膠原酶,,200-400U DNaseI),混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。
六,、室溫1 000×g離心8min,去上清液,。
七,、沉淀中加入20%BSA重懸浮,充分混勻,,1 000×g,,20min,4℃離心,,去上清,。
八、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1%的膠原酶/分散酶,,0.05-0.1%I型膠原酶,,100-300U DNaseI )重懸浮,混勻,,37℃水浴消化0.5-1h,,700×g室溫離心6min,去上清液,。
九,、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50%Percoll(25 000×g,,60min,,4℃),1000×g,,4℃離心10min,。
十、靠近底部的紅細胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,,吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm,,6min,室溫),,去上清液,。
加入DMEM培養(yǎng)液(20%FBS,4ug/ml素 )重懸浮,,接種于含5%的大鼠 血清37℃孵育過夜所制備的細胞培養(yǎng)皿中,,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,,隨后隔天換液,。
注意事項:
1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個月,。
2. 在細胞培養(yǎng)過程中,請注意保持無菌操作,。
3. 傳代培養(yǎng)過程中,yi酶消化時間不宜過長,,否則會影響細胞貼壁及其生長狀態(tài),。
4. 建議客戶收到細胞后前3天每個倍數(shù)各拍幾張細胞照片,記錄細胞狀態(tài),,便于和技術(shù)部溝通,;由于運輸?shù)脑颍瑐€別敏感細胞會出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,,請及時和我們聯(lián)系,,詳盡告知細胞的具體情況,以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問題得到解決,。
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