大鼠胚胎成纖維細(xì)胞的相關(guān)產(chǎn)品：大鼠肺大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞人Ⅱ型肺泡上皮細(xì)胞小鼠腎小球上皮細(xì)胞大鼠多巴胺神經(jīng)元細(xì)胞小鼠外周血淋巴細(xì)胞大鼠骨骼肌成纖維細(xì)胞人外周血淋巴細(xì)胞小鼠全骨髓細(xì)胞大鼠胰腺腺泡細(xì)胞小鼠脊髓星形膠質(zhì)細(xì)胞小鼠棕色脂肪細(xì)胞大鼠骨外膜細(xì)胞小鼠腎上腺皮質(zhì)細(xì)胞大鼠下腔靜脈內(nèi)皮細(xì)胞小鼠表皮角化上皮細(xì)胞

大鼠胚胎成纖維細(xì)胞

一,、細(xì)胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：含FBS,、生長(zhǎng)添加劑,、Penicillin、Streptomycin等

傳代特性：可傳5代左右,；3代以?xún)?nèi)狀態(tài)佳

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：空氣,，95%；CO2,，5%

傳代比例：1:2

細(xì)胞簡(jiǎn)介：大鼠胚胎成纖維細(xì)胞分離自胚胎,；成纖維細(xì)胞(Fibroblast)是疏松結(jié)締組織的主要細(xì)胞成分，由胚胎時(shí)期的間充質(zhì)細(xì)胞分化而來(lái),。成纖維細(xì)胞較大,，輪廓清楚，多為突起的紡錘形或星形的扁平狀結(jié)構(gòu),，其細(xì)胞核呈規(guī)則的卵圓形,，核仁大而明顯。成纖維細(xì)胞功能活動(dòng)旺盛,，細(xì)胞質(zhì)嗜弱堿性,，具明顯的蛋白質(zhì)合成和分泌活動(dòng)，在一定條件下,，它可以實(shí)現(xiàn)跟纖維細(xì)胞的互相轉(zhuǎn)化,；成纖維細(xì)胞對(duì)不同程度的細(xì)胞變性、壞死和組織缺損的修復(fù)有著十分重要的作用,。剛分離的胚胎成纖維細(xì)胞呈圓形,、折光性良好，懸浮于培養(yǎng)基中,。30min細(xì)胞貼壁,，其中部分開(kāi)始伸出偽足，表現(xiàn)為小的突起,；6h后細(xì)胞基本貼壁,，伸展成梭形，胞核清晰,，分布較均勻,，散在生長(zhǎng)，不聚集成團(tuán),；細(xì)胞生長(zhǎng)迅速,，5-7天即呈融合狀態(tài)，細(xì)胞排列緊密，有的交叉重疊生長(zhǎng),，平坦,、胞體較大，細(xì)胞質(zhì)透明,，細(xì)胞核較大,，呈橢圓形，顏色淡,。細(xì)胞融合,，并彼此連接成網(wǎng)狀；細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。細(xì)胞呈突起的紡錘形或星形的扁平分布,。該細(xì)胞常用作ES細(xì)胞培養(yǎng)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞，能產(chǎn)生抑制ES細(xì)胞自主分化和促進(jìn)ES細(xì)胞增殖的因子,，故能有效地促進(jìn)ES細(xì)胞的增殖并維持其未分化特性和多潛能性,，且分泌效果優(yōu)于外源添加的一些因子，而且可以為ES細(xì)胞的培養(yǎng)提供類(lèi)似于體內(nèi)的微環(huán)境,，故在研究哺乳動(dòng)物ES細(xì)胞中得到廣泛使用,。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠,，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min。

二,、在超凈工作臺(tái)中,，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中，打開(kāi)顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦,。

三、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,。

四、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小,，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min,，室溫),，去上清液。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS,，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個(gè)月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,，請(qǐng)注意保持無(wú)菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過(guò)程中，yi酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài),。

4. 建議客戶(hù)收到細(xì)胞后前3天每個(gè)倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通,；由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系,，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問(wèn)題得到解決,。
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