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人關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞

一,、細(xì)胞基本屬性

 

培養(yǎng)基：原代成纖維細(xì)胞培養(yǎng)體系

傳代特性：細(xì)胞特性確定傳代

消化液：0.25%胰dan白酶

培養(yǎng)條件：氣相：  空氣,，95%；CO2 ,，5%

細(xì)胞簡(jiǎn)介：滑膜是關(guān)節(jié)囊的內(nèi)層,，淡紅色，  平滑閃光,，薄而柔潤(rùn),，由疏松結(jié)締組織組成。關(guān) 節(jié)腔內(nèi)的所有結(jié)構(gòu),，  除關(guān)節(jié)軟骨,、半月軟骨板以外,即便是通過(guò)關(guān)節(jié)腔的肌腱、韌 帶等均全部為滑膜所包裹,。

滑膜分泌滑液,，  在關(guān)節(jié)活動(dòng)中起重要作用。正?；し譃閮蓪?，即薄的細(xì)胞層(內(nèi) 腔層)和血管層(內(nèi)膜下層)，是血管豐富的關(guān)節(jié)囊內(nèi)膜,，貼附于非關(guān)節(jié)面部分,，覆 蓋于關(guān)節(jié)囊內(nèi)的骨面上,，  不在軟骨面上，  此部分稱為邊緣區(qū)或“裸區(qū)",?；こ?nbsp;粉紅色，光滑發(fā)亮,、濕而潤(rùn)滑,，  有時(shí)可見(jiàn)絨毛，內(nèi)含膠原性纖維,。

滑膜細(xì)胞有A,、  B兩型。巨噬細(xì)胞樣A型細(xì)胞,，  表面有絲狀偽足,、漿膜內(nèi)陷、囊泡  ,、線粒體,、溶酶體、胞漿纖維和高爾基體,，具有吞噬功能,；  B型成纖維樣滑膜細(xì)胞 (FLS) ，有高濃度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu),，  是介導(dǎo) RA 關(guān)節(jié)破壞的主要細(xì)胞,。
原代細(xì)胞分離培養(yǎng)的思路：

取材--分離--培養(yǎng)--鑒定

首先將組織從機(jī)體中取出，經(jīng)胰dan白酶/膠原酶處理后分散成單細(xì)胞,，再在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng),，使細(xì)胞繁殖到一定系數(shù)后進(jìn)行細(xì)胞鑒定。

實(shí)驗(yàn)步驟：

一,、取7-10d雄性SD大鼠，頸椎脫臼處死,浸泡于75％乙醇消毒3-5min,。

二,、在超凈工作臺(tái)中，將大鼠斷頭置于玻璃培養(yǎng)皿中,，打開顱腔后取出全腦,放在盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中,，去除小腦和間腦。

三,、將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動(dòng)以去除軟腦膜和腦膜大血管,，再放在新的盛有預(yù)冷的PBS玻璃培養(yǎng)皿中。

四,、用細(xì)解剖鑷去除大腦白質(zhì),、殘余大血管和軟腦膜,，保留大腦皮質(zhì)。

五,、大腦皮質(zhì)放于DMEM中,，剪碎成約1mm3大小，放入50ml的離心管中,，加入混合酶液I(0.05-0 .1％II型膠原酶,，0 .025-0 .05％IV型膠原酶，200-400U DNaseI),，混勻后37℃水浴消化1-1.5h,。

六、室溫1 000×g離心8min,，去上清液,。

七、沉淀中加入20％BSA重懸浮,，充分混勻,，1 000×g，20min,，4℃離心,，去上清。

八,、沉淀加入4ml混合酶液II( 0.05-0.1％的膠原酶/分散酶,，0.05-0.1％I型膠原酶，100-300U DNaseI )重懸浮,，混勻,，37℃水浴消化0.5-1h，700×g室溫離心6min,，去上清液,。

九、沉淀加入2ml DMEM培養(yǎng)液懸浮混勻,，鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的12ml 50％Percoll(25 000×g,，60min，4℃),，1000×g,，4℃離心10min。

十,、靠近底部的紅細(xì)胞層之上的白黃色的層面即為純化的微血管段,，吸出后DMEM漂洗兩次(離心1000×rpm，6min，室溫),，去上清液,。

加入DMEM培養(yǎng)液(20％FBS，4ug/ml素 )重懸浮,，接種于含5％的大鼠 血清37℃孵育過(guò)夜所制備的細(xì)胞培養(yǎng)皿中,，置于37℃、5％CO2培養(yǎng)箱內(nèi)靜置培養(yǎng)24h后更換不含素的混合培養(yǎng)基,，隨后隔天換液,。

注意事項(xiàng)：

1. 培養(yǎng)基于4℃條件下可保存3-6個(gè)月。

2. 在細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中,，請(qǐng)注意保持無(wú)菌操作,。

3. 傳代培養(yǎng)過(guò)程中，yi酶消化時(shí)間不宜過(guò)長(zhǎng),，否則會(huì)影響細(xì)胞貼壁及其生長(zhǎng)狀態(tài),。

4. 建議客戶收到細(xì)胞后前3天每個(gè)倍數(shù)各拍幾張細(xì)胞照片，記錄細(xì)胞狀態(tài),，便于和技術(shù)部溝通,；由于運(yùn)輸?shù)脑颍瑐€(gè)別敏感細(xì)胞會(huì)出現(xiàn)不穩(wěn)定的情況,，請(qǐng)及時(shí)和我們聯(lián)系,，詳盡告知細(xì)胞的具體情況，以便我們的技術(shù)人員跟蹤,、回訪直至問(wèn)題得到解決,。
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